СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, а именно к способу получения препарата, регулирующего развитие широкого круга растений.

Неблагоприятная экологическая обстановка, сложившаяся в мире, способствует поиску новых экологически чистых и дешевых биотехнологий, в частности, разработке способов получения новых дешевых и удобных в применении биопрепаратов для культивирования растений как альтернативы химическим средствам.

Получение регуляторов роста путем микробиологического синтеза имеет преимущество перед химическими способами, т.к. позволяет получать природные соединения мягкого действия. Продукты жизнедеятельности микроорганизмов-продуцентов имеют значительные преимущества перед синтетическими регуляторами и очищенными микробными веществами. Неочищенные и малоочищенные микробные препараты, содержащие кроме основного действующего начала - фитогормонов смесь биологически активных веществ, зачастую в оптимальных сочетаниях, хорошо сбалансированных для проявления желаемого биологического эффекта, более экономичны и полифункциональны. Однако известные методы их получения включают многоступенчатую систему фракционирования и очистки препаратов, что усложняет процесс, ведет к его удорожанию и снижает выход препарата из-за потерь.

Применение регуляторов роста в сельскохозяйственной практике, особенно в повышении устойчивости растений к экстремальным условиям, регулировании процессов вегетативного роста, корнеобраэования, прорастания семян и клубней и т.д. не соответствует реальным потребностям, сфера их практического применения довольно ограничена, в частности, из-за недостаточного количества доступных дешевых отечественных препаратов, способов их получения, транспортировки, хранения.

Известны способы, в которых получение биопрепаратов достигается культивированием различных микроорганизмов с последующим выделением и использованием определенных веществ в качестве препарата (Япония: з. №62 - 20163, з. №1 - 79101, РСТ №87/06796).

Однако этот путь сложен, многоступенчат и ведет к получению узконаправленных препаратов.

Известны регуляторы роста растений, обладающие широким спектром действия (гиббрелин, гибберсиб) для широкого круга растений и повышающие урожай на 15 - 20%. Однако эти препараты нерастворимы в воде, а в 0,5% водном растворе аммиака плохо сохраняются. (Микробные фитогормоны в растениеводстве. - Рига: Зенитне, 1988).

Известны способы получения биопрепаратов, в основе которых положено культивирование микроорганизмов с последующим суспендированием их биомассы в воде либо физиологическом растворе (А.с. СССР №1423550, №1555320, №1698242, №1699990, №1712348, ГДР э.п. №272986, ЧССР а.с. №256150. США п. №4818530, п. №4718935).

Однако эти способы, использующие монокультуры, ведут к получению препаратов регулирующих развитие одного вида растений и на определенном этапе.

Известен способ получения регулятора роста растений из фильтрата культуральной жидкости микроорганизмов, однако, он характеризуется многоступенчатостью, использованием разнообразных экстрагентов и растворителей (Stowe В.В. Yamaki T. Ann & Reu & Plant Physiol., 8, 181 - 216, 1956).

В основу изобретения поставлена задача создания способа получения регулятора роста растений, в котором за счет выращивания штамма микроскопического гриба в оптимальных для него условиях и последующего выделения продуктов метаболизма, обеспечивается простота получения биологически активного препарата широкого спектра действия, недорогого и удобного в применении.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения регулятора роста растений, включающем культивирование микроорганизма на жидкой питательной среде с последующим выделением продуктов метаболизма, согласно изобретению культивируют штамм микроскопического гриба Cylindrocarpon magnusianum ИМВ F-100004 на жидкой питательной среде в условиях аэрации при t 22 - 28°C в течение 30 суток с последующим экстрагированием продуктов метаболизма 70% этиловым спиртом при объемном соотношении компонентов культуральная жидкость : спирт 2,5 : 1, причем перед экстрагированием проводят адсорбцию с помощью активированного угля в течение 6 - 8ч, добавляя его в количестве 0,5г на 250мл культуральной среды.

Способ осуществляют следующим образом.

Культивируют штамм Cylindrocarpon magnusianum ИМВ F-100004, имеющий такие характеристики:

Штамм выделен из корневой системы облепихи. Идентифицирован по Кириленко Т.С. Атлас родов почвенных грибов (Ascomycetes и Fungi imperfecti). - К.: Наук. думка, 1977. - С.127; Пидопличко Н.М. Грибная флора грубых кормов. - К.: Изд-во АН УССР, 1953. - С.485.

Штамм депонирован в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины под N ИМВ F-100004.

Морфологическая характеристика штамма.

При микроскопировании культуры, выращенной на агаризованной среде сусло, среде Чапека, картофельном агаре, гифы 2,0 - 3,0мкм толщиной, неокрашены, часто в тяжевидных пучках, разветвленные. Конидиеносцы одиночные, простые, слаборазветвленные, суживающиеся к верхушке, размеры 10,0 - 20,0 × 2,9 - 3,5мкм. Конидии цилиндрические, прямые, реже слегка согнутые, закругленные на концах или тупоконусовидные с сосочком у основания, с 0 - 3 перегородками, чаще с 1 перегородкой, размеры 10,0 - 42,5 × 5,3мкм. Хламидоспоры 5,0 - 12,0мкм в диаметре, сначала неокрашенные, затем коричневые, гладкие. шаровидные или грушевидные, интерколярные или верхушечные, одиночные или в коротких цепочках.

На жидкой глюкозо-аспарагиновой среде, не сбалансированной по углероду и азоту, в гифах находится большое количество включений жировой природы сферической либо овальной формы. На картофельном отваре включения встречаются в меньшем количестве и мельче по размеру.

Культуральные свойства штамма.

Штамм хорошо растет на агаризованных питательных средах: пивном сусле, картофельном агаре, среде Чапека, жидкой глюкозо-аспарагиновой среде.

На агаризованном пивном сусле при 25 - 28°C колонии пушисто-войлочные, белые до кремоватых или телесных. На обратной стороне - светло-коричневые, радиально лучистые.

На агаризованной среде Сабуро (пивное сусло + МПА в равных соотношениях (в возрасте 15 суток) колонии 2 - х типов: 1) Диаметр колоний 80мм. На расстоянии 25мм от центра слабо-войлочная, затем (20мм) пушистая белого цвета. На обратной стороне бесцветная или слабо соломенного оттенка. 2) Диаметр колонии 62мм, в центре (20мм) выпуклая, пушистая, слегка кремового оттенка, затем (по кольцам) войлочная светло-оливкового цвета, войлочная пушистая желтовато-кремоватого оттенка, слабовойлочная слегка фиолетового оттенка, край колонии фиолетово-белого оттенка. Обратная сторона - темно-красно-коричневого цвета.

При выращивании в стационарных условиях на жидкой глюкозо-аспарагиновой и сахарозо-аспарагиновой средах рост слизистый, желеобразный, бесцветный. На среде с сахарозой при добавлении K - Na лимоннокислого либо аммония лимоннокислого культура растет в виде опушенных пеллет или слизистых сгустков. Культуральная жидкость при этом окрашивается в слегка коричневатый цвет. При выращивании на качалках в колбах емкостью 250мл с 50мл питательной среды культура растет в виде пеллет либо слизистых тяжей, окрашенных в слегка соломенный или коричневый цвет.

На жидких средах с добавлением органических источников азотного питания (смеси аминокислот, пептона), на средах сложного состава (растительные отвары) рост культуры и пигментообразование усиливаются.

Физиологические свойства штамма.

Штамм растет на дефицитной по азоту среде и является олигонитротолерантным микрорганизмом. На среде с низким содержанием азота синтезирует небольшое количество соединений белковой природы.

Развитие штамма улучшается и ускоряется при добавлении в среду легкодоступных связанных форм азотного питания: нитратного, аммонийного, органического.

Из источников питания усваивает глюкозу, сахарозу, крахмал, маннит. Не растет на среде с целлюлозой.

В процессе роста в зависимости от состава питательной среды в большей или меньшей степени подкисляет последние (до pH 5,8 - 3,5). Реакция среды остается без изменений (pH 7,0) при выращивании штамма на глюкозо-аспарагиновой среде. На этой среде культура синтезирует биологически активные вещества - комплекс, состоящий из углеводов, жирных кислот, аминокислот, веществ цитокининовой природы, обладающие ростактивирующими свойствами по отношению к сельскохозяйственным растениям.

Штамм является микроаэрофильным и мезофильным микроорганизмом. Не требователен к источникам питания. Растет на жидкой глюкозо-аспарагиновой среде в колбах на 0,75л с 0,25л питательной среды при t 22 - 25°C в стационарных условиях. Культура сохраняется без пересевов в течение 6 и более месяцев.

Состав среды (г/л): глюкоза - 10,0; аспарагин - 0,02; KH₂PO₄ - 0,9; K₂НРО₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,1; K₂SO₄ - 0,1; MnSO₄ - 0,02; FeSO₄ - 0,02; CuSO₄ - 0,02; вода водопроводная - 1л; pH 7,0.

При росте культуры на минеральной среде дефицитной по азоту, pH культуральной жидкости 7,0 - 7,3. На азотсодержащих средах pH снижается до 6,5 - 3,2.

Долгосрочное хранение штамма с периодическими пересевами через 6 месяцев и сохранением биологических свойств осуществляется на жидкой питательной среде следующего состава: г/л: глюкоза - 10,0, аспарагин - 0,02, KH₂PO₄ - 0,9; K₂НРО₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,2; FeSO₄ - 0,02; CuSO₄ - 0,02, pH 7, t 5 - 7°C. Возможно хранение на этой же среде с добавлением агара (20г/л).

Микромицет Cylindrocarpon magnusianum ИМВ F-100004 для получения комплекса биологически активных веществ - регуляторов роста растений выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0; аспарагин - 0,02; KH₂PO₄ - 0,9; K₂НРО₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,1; FeSO₄ - 0,02; CuSO₄ - 0,02; K₂SO₄ - 0,1; MnSO₄ - 0,02; вода водопроводная - 1л, pH 7,0.

Культивирование проводят в стационарных условиях в колбах емкостью 750мл с 250мл питательной среды при t 22 - 28°C в течение 30 суток в условиях аэрации. Культура по окончании инкубирования слизистая, бесцветная либо слегка кремоватого оттенка, медузовидная.

Адсорбцию продуктов жизнедеятельности осуществляют, добавляя в колбу с биомассой и культуральной жидкостью 0,5г активированного угля. Жидкость перемешивают в течение 6 - 8 часов, после чего содержимое колбы фильтруют на воронке Бюхнера с бумажным фильтром в колбу Бунзена.

Для экстракции продуктов метаболизма в колбу добавляют 50мл 70% спирта, перемешивают 6 - 8 часов, затем содержимое колбы фильтруют в воронке Бюхнера. Общий выход водно-спиртового элюата-регулятора роста растений составляет 90% за счет потерь при операции фильтрования.

Водно-спиртовый раствор регулятора роста хранят в темном месте при комнатной температуре и проверяют его эффективность биологическим методом по способности стимулировать физиологические процессы у высших растений.

Определение биологической активности регулятора роста проводят по измерению длины проростков пшеницы в присутствии препарата по сравнению с контролем.

Семена пшеницы предварительно стерилизуют в растворе перекиси водорода в течение 5 минут с последующим промыванием в стерильной дистводе.

Препарат для испытаний разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1 : 10000. В 8 стерильных чашек Петри раскладывают по 5 штук семена, затем в 4 опытные чашки наливают по 15см³ раствора препарата, в 4 контрольные - по 15см³ воды. Чашки инкубируют в термостате при 24°C. Через 7 суток измеряют длину проростков и определяют среднее значение. Биологическую активность выражают в процентах по отношению к контролю. Увеличение длины проростков пшеницы на 15 - 20%.

Влияние полученного таким способом регулятора роста растений приведено в таблице.

Как видно из приведенного выше, способ прост, дешев, доступен и приводит к получению эффективного регулятора роста растений.