TEMPERATURE SENSITIVE HYDROGEL COMPOSITION INCLUDING NUCLEIC ACID AND CHITOSAN
명세서 발명의명칭 :핵산및키토산을포함하는온도감웅성하이드로겔 조성물 기술분야 본발명은핵산및키토산을포함하는온도감웅성하이드로겔조성물에관한 것이다. 배경기술 하이드로겔 (hydrogd)이란수상을함유하는 3차원망상구조를가지는고분자 구조체를의미하며 (Rohindra D.R. et al., 2004),친수성고분자사이에공유결합 또는비공유결합이이루어져형성된다 (황준석 et al., 2008).다양한친수성 고분자로이루어진하이드로겔은높은함수율을지니고있어 생체적합성 (biocompatibility)이우수하기때문에생체소재로웅용하기위한많은 연구가이루어져왔다.특히 pH,은도，전기장，자기장，빛，초음파등의 자극 (stimuli)에민감한하이드로겔은자극의존재여부에따라제어방출이 가능한약물전달시스템에이용될수있다 (Hoffman A.S., 2002). 이중온도감웅성하이드로겔은조직재생용세포전달체와약물전달 시스템에서가장널리연구되고있다.이는많은고분자들이온도전이특성을 나타내고있기때문으로，일반적인고분자를물에용해또는팽윤할수있는 친수기그룹을도입하게되면그고분자는물에의해용해또는팽윤되어온도의 증가에따라물에 대한용해성은증가하나친수성과메틸,에틸및프로필등과 같은소수성부분으로구성된고분자는온도증가에따라물용해성이감소하는 저임계용액온도 (lower critical solution temperature, LCST)를갖게되어온도가 증가할때웅축하여 겔이형성된다 (Ward M.A. et al., 2011).즉,친수성과소수성 부분으로구성된고분자는낮은온도에서는고분자의친수기와물분자사이의 수소결합력이우세하여물에용해되어졸 (sol)상태가되지만，은도를 증가시키면고분자의소수기부분의결합력이수소결합력보다우세하게 되므로고분자의소수기부분이웅집하여 겔 (gel)상태로상전이 (phase transition)가발생한다. 이러한고분자용액이일반적인온도에서유체와같은졸상태일경우에는 단순한흔합과정을통해약물의흔합이가능하며인체온도이상의열이가해질 경우에는겔을형성하여약물의서방형방출 (sustained release)이가능하게된다. 그러나이러한고분자는인체내에서사용된후인체의신진대사에의해체외로 방출되어야한다.따라서의료용또는인체에적용하기위한온도감웅성 하이드로겔의경우에는생체적합성 (biocompatibility)및 생분해성 (biodegradability)성질을띠도록하는것이중요하다. 현재까지연구된온도감웅성하이드로겔조성물의함량비율을살펴보면，
소수성-친수성결합에의해나타나는온도감웅성하이드로겔의경우에는 조성물들의반웅농도가높은것을알수있었다.반응농도가높다는것은 하이드로겔의인체주입에의한인체에대한영향을줄수있을뿐만아니라 인체내에서의분해속도에도영향을줄수있다.따라서낮은농도에서도 온도감웅성을나타낼수있는하이드로겔의개발은좀더안전한생체적합성 물질개발에도움을줄수있다. 하이드로겔을구성하는고분자에는키토산 (chitosan)(Berger J. et al., 2004), 알지네이트 (alginate)(Augst A.D. et al., 2006),덱스트란 (dextran), 히알루론산 (hyaluronic acid),젤라틴 (gelatin),콜라겐 (collagen)등의천연 고분자와폴리비닐알코을 (poly(vinylalcohol))(Bodugoz-Senturk H., et al., 2009), 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine)(Jin R.H. et al., 2005), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol))(Mahoney M.J. et al., 2006)등의합성 고분자가있다. 키토산 (diitosan)은게나일반새우,가재등의갑각류，갑오징어등의연체류， 곤층류및세균의세포벽둥에서얻을수있는 N-아세틸 -Z)-글루코사민 (N-acetyl- D-glucosamine)이 β-(1→4)결합한형태의천연다당류인키틴을 탈아세틸화 (deacetylation)하여제조할수있다.키토산은무기산수용액에쉽게 용해되므로폐수처리용웅집제，중금속흡착제,삭품및화장품둥다양한 분야에활용되고있다.또한，키토산은천연물에사얻어지는다당류로서 생체적합성및생분해성이우수할뿐만아니라세포의결합및생체조직배양， 항균성，향취성，무독성，지혈작용등의생리활성이 있는것으로 보고되었다 (박준규 et al., 2015). 유전정보를저장하고전달하는유전체로서인식되어오던핵산 (nucleic acid)이 질환조직주변에분포되어세포성장과분화，혈관생성촉진과염증억제기능을 한다고알려져있다.즉，핵산이세포외부에서작은조각으로분해되어세포 표면의수용체와결합하여세포내부로신호를자극하는역할을한다. 또다른연구분야에서는핵산의고유한자가조립 (self assembly)성질을 이용하여매우정교한나노구조물을만드는둥다양한분야에서활발하게 연구가진행되고있다. 2006년에 DNA로이루어진하이드로겔의형성결과가 발표 (Um S.H. et al., 2006)된이후，많은그룹에서 DNA를이용한겔을제작하는 연구가이루어지고있다. [ 10] DNA로이루어진하이드로겔의경우생체적합성이매우뛰어나서의학적으로 다양한분야에서연구되어지고있다.최근에는열과효소에반응하여분해및 재결합이자유로운기능성 DNA하이드로겔을제조한결과가발표되기도 하였다 (Xing Y. et aL, 201 1).따라서필요시에만약물을홀려보내는스마트약물 전달방법이가능하게됨으로써약물의과다복용으로인한부작용을줄일수 있는장점이 있다.또한，기존의폴리머를이용한하이드로겔제조방법과달리， DNA하이드로겔은생체물질인 DNA로이루어져 있어서인체에독성이없다는
장점을가지고있기때문에,다양한모양의상처부위를위한인공조직으로서의 사용및효과적인약물전달체로서의료분야에서다양한웅용이기대되고있다. 그러나핵산은인체에존재하는분해효소들로인해쉽게분해되어표적이되는 질환조직에핵산을적용하기위한체내체류성이낮아약효지속성이부족할 뿐만아니라 DNA하이드로겔로활용할경우분해효소들로인한분해로인해 구조물의붕괴가일어나인공조직및약물전달체로서의 역할을제대로수행할 수없게되는문제점을가지고있다 (이종범 et al., 2012).따라서이러한핵산의 약효지속성강화및 DNA하이드로겔의문제점올해결하기위한연구의진행이 필요하다. 이에,본발명자는상온에서는졸의상태로존재하다가체내에주입하게되면 겔을형성하는온도감웅성하이드로겔을제조하기위해지속적으로연구한 결과키토산과핵산의조합을통해생체적합성및생분해성을지닌온도감웅성 하이드로겔을제조함으로써본발명을완성할수있었다. 종래선행기술로서한국공개특허제 2014-0090670호에서는인시츄가교결합성 중합체조성물이개시되어 있으나，온도감웅성및하이드로겔에대해서는 언급된바가전혀없다.또한，이공개특허의가교결합성중합체조성물은약 0.1증량 %내지약 95중량%의 1종초과의다중음이온중합체，약 0.1증량 %내지 약 90중량 %의 1종초과의다중양이은중합체및 0.1중량 %내지 99.8중량%의 물을포함하는것으로서,본발명의온도감웅성하이드로겔조성물의 흔합비율의구성과차이가있다.또한,상기다중음이온으로는가교결합성및 비가교결합성다중음이온을포함하는것으로개시하고있으며,비가교결합성 다중음이온성분의하나로폴리뉴클레오타이드를제시하고있다.그러나 비가교결합성다중음이온와경우는추가로포함되는것으로개시되어 있으며 가교결합에는영향을주지않는것을알수있다.반면，본발명의경우핵산및 키토산간의비가교결합을통해온도감웅성하이드로겔을형성하는것으로，그 구성에 있어차이가있음을알수있다.추가적으로한국공개특허 제 2014-0090670호에서제시된비율을참고하여 1중량 9¾의핵산및 0.1증량 %의 키토산을흔합한결과불투명한하얀침전이생기고 3일후에는층분리가 일어나는것을확인하였다. 유럽공개특허제 2745849호에서는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide, PDRN)와키토산의 조합에대해개시되어 있으나,온도감웅성하이드로겔을언급하고있지않으며, 0.002내지 0.25중량 %의폴리데옥시리보뉴클레오타이드및 1내지 10중량 %의 키토산을포함하는것으로，본발명의구성과차아가있음을알수있다. 또한,미국공개특허제 2015-0111834호에서는인시츄 (in-situ)겔의조성물에 대해서개시하고있으며,상온에서의겔화방지를위해겔방지제를 넣어줌으로써，본발명의구성과차이가있음을알수있다.
발명의상세한설명 기술적과제 본발명의목적은핵산및키토산을포함하는은도감웅성하이드로겔조성물을 제공하는데있다. 과제해결수단 본발명은핵산및키토산을포함하며，핵산및키토산의중량비율이 20: 1내지 10000:1인은도감웅성하이드로겔에관한것이다. [18] 바람직하게는핵산및키토산의중량비율이 50:1내지 2000: 1이고，가장 바람직하게는핵산및키토산의중량비율이 100:1내지 1000:1인은도감웅성 하이드로겔조성물일수있다. [19] 상기핵산의함량은조성물의총중량을기준으로 0.01중량 %내지 3중량 %일 수있다. 상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA),리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의혼합물일수있다. [21] 상기키토산의함량은조성물의총중량을기준으로 lxlO-6중량 %내지 0.15중량 %일수있다. [22] 상기키토산의분자량은 3kDa내지 l,000kDa일수있다. [23] 또한,상기온도감웅성하이드로겔은고분자물질을추가성분으로포함할수 있다. 상기고분자물질은히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리감마글루탐산 (poly-Y-glutamic acid),셀를로오스 (cellulose), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid),폴리아미노산 (polyamino acid), 알지네이트 (alginate),이들의유도체및이들의조합으로이루어진군중에서 선택되는 1종이상일수있다. 또한,본발명은 i)핵산저장용액을제조하는단계; ii)키토산저장용액을 제조하는단계 ; iii)상기 i)단계의핵산저장용액및상기 ii)단계의키토산 저장용액을핵산및키토산의중량비율이 20:1내지 10000: 1이되도록흔합하여 교반하는단계;및 iv)상기 iii)단계의핵산-키토산흔합액을교반하면서 상온으로낮추는단계;를포함하는온도감웅성하이드로겔조성물의제조 방법에관한것이다. 상기제조방법은 i)핵산을완충용액 (buffer)에넣고 60oC내지 70°C에서 교반하면서 1시간내지 2시간동안용해시켜핵산저장용액을제조하는단계; ii) 키토산을산성완충용액에용해시켜키토산저장용액을제조하는단계; iii)상기 i)단계의 핵산저장용액및상기 ii)단계의키토산저장용액을핵산및키토산의 중량비율이 20: 1내지 10000:1이되도록혼합하여 55°C내지 65°C에서 1시간내지 2시간동안교반하는단계;및 iv)상기 iii)단계의핵산-키토산흔합액을 교반하면서상온으로낮추는단계;를포함할수있다.
상기온도감응성하이드로겔조성물의삼투압이 lOOmOsm내지 500mOsm 이고, pH가 6내지 8이되도록하는온도감웅성하이드로겔조성물의제조 방법이다. 이하본발명을상세하게설명한다. 상기온도감웅성하이드로겔이라는것은온도에따라졸 (sol)이겔 (gel)로또는 겔이졸로상전이 (phase transition)가일어나는하이드로겔을일컫는것으로,졸이 겔로변하는현상을겔화 (gelation)라고하며,본발명에서의겔화는점탄성을 가지며온도가증가함에따라고분자가 3차원그물구조를형성하여용매에 녹지않고잔류하는상태가되는것으로정의한다. 상기핵산및키토산을포함하는온도감웅성하이드로겔조성물은핵산및 키토산의배합비율에따라졸-겔전이온도가달라질수있으며，이때사용하는 목적에따라배합비율을바꾸어졸-겔전이온도를조절할수있다. 상기핵산및키토산을포함하는은도감웅성하이드로겔조성물은 균일 (homogeneous)한상태를유지하며층분리가일어나지않는 안정성 (stability)이높은것으로,핵산및키토산의중량비율이 20:1내지 10000:1의범위인것이바람직하며핵산및키토산의증량비율이 50:1내지 2000:1의범위인것이보다바람직하고,핵산및키토산의중량비율이 100:1내지 1000:1의범위인것이가장바람직하다. 상기핵산의함량이조성물의총중량을기준으로 0.이중량 %내지 3중량 %일 수있고，바람직하게는 0.1중량 %내지 2중량 %이며,가장바람직하게는 1중량 % 내지 1.5중량%일수있다. 상기핵산의분자량은 lkDa내지 100,000kDa일수있다.바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고,가장바람직하게는 50kDa내지 3,500kDa일수있다. 상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA),리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의흔합물일수있다.바람직하게는디옥시리보핵산일수 있다. 또한,상기디옥시리보핵산은올리고뉴클레오타이드 (oligonuclotide), 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide, PDRN)일수있다. [36] 상기핵산은키토산과의결합을통해하이드로겔을형성할수있으며체내에서 치료약물로작용할수있다. [37] 또한，상기키토산의함량은조성물의총중량을기준으로 IxlO-6중량 %내지 0.15중량 %일수있고，바람직하게는 ΐχΐο-5중량 %내지 αι중량 %이며，가장 바람직하게는 IxlO4중량 %내지 0.075중량 %일수있다. [38] 상기키토산의분자량은 3kDa내지 l,000kDa인것이바람직하나,이에 한정되지않는다. 또한，상기온도감웅성하이드로겔조성물에는고분자물질을추가성분으로 포함할수있으며，이때의고분자물질은핵산및키토산을포함하는온도감웅성
하이드로겔의사용용도에따른물성변화조절을공고히하기위해추가할수 있다. 상기고분자물질로는히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리감마글루탐산 (poly-Y-glutamic acid),샐롤로오스 (cellulose), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid),폴리아미노산 (polyamino acid), 알지네이트 (alginate),이들의유도체및이들의조합으로이루어진군으로부터 선택되는 1종이상이사용될수있으나，이에한정되지않는다. 또한,상기온도감웅성하이드로겔조성물은의료용및화장료로이용할수 있다. 상기온도감웅성하이드로겔제조방법은 i)핵산을완충용액 (buffer)에넣고 60°C내지 70oC에서교반하면서 1시간내지 2시간동안용해시켜핵산 저장용액을제조하는단계； ii)키토산을산성완층용액에용해시켜키토산 저장용액을제조하는단계 ; iii)상기 i)단계의핵산저장용액및상기 ii)단계의 키토산저장용액을핵산및키토산의중량비율이 20: 1내지 10000: 1이되도록 흔합하여 55°C내지 65°C에서 1시간내지 2시간동안교반하는단계;및 iv)상기 iii)단계의핵산-키토산흔합액을교반하면서상온으로낮추는단계；를 포함하는제조방법이다. 상기핵산저장용액제조시아용할수있는완충용액으로는소듬포스페이트 디베이직도데 ^하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨 (sodium chloride),염화마그네슘 (magnesium chloride), 염화칼륨 (potassium chloride),인산완충식염수 (phosphate buffer sline)또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)완층용액이 있으며，바람직하게는소듐포스페이트디베이직도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)를이용할수있으나,이에한정하는것은아니다. 상기키토산저장용액제조시이용할수있는산성완층용액으로는 아세트산 (acetic acid),염산 (hydrochloric acid),아스코르브산 (ascorbic acid), 젖산 (lactic acid),질산 (nitric acid)이 있으며,바람직하게는아세트산 (acetic acid)을 이용할수있으나，이에한정하는것은아니다. 상기핵산및키토산의흔합은핵산및키토산의중량비율이 20:1내지 10000:1이되도록흔합하며이때，핵산의함량이조성물의총중량을기준으로 0.01중량<¾내지 3중량 %이되고，키 £산의함량이조성물의총중량을기준으로 lxlO-6중량<¾내지 0.15중량 %이되도록하는것이바람직하다. 상기제조방법으로제조된온도감웅성하이드로겔조성물은삼투압및 pH가 인체내에주입또는피부에도포할수있도록조절될수있다. 상기 제조방법으로제조된온도감응성하이드로겔조성물의 pH를조절하기 위해제조방법의단계중상기 iv)단계에 pH를조절하는단계를추가로포함할 수있다. 상기제조방법으로제조된은도감웅성하이드로겔조성물의삼투압은
lOOmOsm내지 500mOsm일수있고,바람직하게는 150mOsm내지 450mOsm이며，가장바람직하게는 200mOsm내지 400mOsm일수있다. [49] . 상기제조방법으로제조된온도감웅성하이드로겔조성물의 pH는 6내지 8일 수있고，바람직하게는 pH가 6.5내지 7.5이며，가장바람직하게는 pH가 7일수 있다. 발명의효과 본발명은핵산및키토산을포함하는온도감웅성하이드로겔조성물을 제공한다.상기하이드로겔은생체적합성과생체안정성이우수하고동시에 온도변화에따른졸-겔상전이 (phase transition)의성질을띠고있어상온에서는 졸의상태로존재하다인체내주입또는표피피부표면에도포하여온도가 높아지면겔화된다. 따라서본발명의은도감웅성하이드로겔은치료가필요한특정부위에 직접적인주입및도포가가능하고온도에따른겔화를통해약물의체류및 부착시간을높임으로써약효를층분히발휘할수있도록할수있어다양한 치료에활용할수있을것으로기대된다. 도면의간단한설명 [52] 도 1은핵산및키토산의흔합비율에따른온도감웅성하이드로겔의물성 상태를확인한결과이다.각각의조성물을흔합한후 3일동안투명도와점탄성 여부 (A)및침전물생성및층분리여부 (B)를확인하였다. [53] 도 2는겔의용해성여부를확인한결과를보여주고있다. [54] 도 3은은도감웅성하이드로겔조성물의졸-겔전이를확인한결과를보여주고 있다. 발명의실시를위한최선의형태 [55] 이하본발명의바람직한실시예를상세히설명하기로한다.그러나，본발명은 여기서설명되는실시예에한정되지않고다른형태로구체화될수도있다. 오히려，여기서소개되는내용이철저하고완전해지고，당업자에게본발명의 사상을충분히전달하기위해제공하는것이다. [56] <실시예 1.핵산-키토산하이드로겔제조> 핵산-키토산하이드로겔을제조하기위해핵산과키토산저장용액 (stock solution)을하기표 1의실시예에해당되는농도로준비하였다.이때,핵산의 경우 200mM소듐포스페이트디베이직도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완충용액에넣고 65°C의열교반기를이용하여 1시간이상 용해시켰다. 키토산은 100mM아세트산 (acetic acid)을이용하여용해시켰다. 하기표 1의농도로준비한핵산과키토산저장용액을 1:1중량비율로 흔합하여 60oC의열교반기에서 1시간동안교반하였다.그후,온도를상은으로 낮추며 1시간동안교반하여핵산-키토산하이드로겔을제조하였다.
<비교예 1.비교대상핵산-키토산하이드로겔제조 > 하기표 1의비교예에해당되는농도조건으로핵산및키토산저장용액 (stock solution)을준비하였다.실시예 1의방법과동일하게비교대상핵산-키토산 하이드로겔을제조하였다. [표 1] <실시예 2.핵산-키토산 -히알루론산하이드로겔제조 > 핵산-키토산 -히알루론산하이 S로겔은다음과같은과정을통해제조하였다. 핵산은 2.2중량 %농도가되도록 200mM소듐포스페이트디베이직 도데카하이드레.이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완층용액에 용해시켰다.이때 65°C의열교반기를이용하여 1시간이상용해시켰다. 키토산은 0.4중량 %농도가되도록 lOOmM아세트산 (acetic acid)에용해시켰다. 히알루론산나트륨은 2중량<¾농도가되도록 200mM소듐포스페이트 디베이직도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완층용액에용해시켰다.이때 40oC의열교반기를이용하여 30분동안용해시킨 후,교반기로교반시키면서상온이되도록식혀주었다. 준비된 2.2중량 %핵산과 0.4중량 %>키토산용액을 9:1의중량비율로흔합하여
65°C의열교반기에서 10분간교반하였다.핵산 -키토산흔합용액에 2중량 %의 히알루론산나트륨을 1:1중량비율로추가흔합하여 65°C의열교반기에서 1시간 교반후,교반을유지하면서상온이되도록식혀주어실시예 2의 핵산-키토산 -히알루론산하이드로겔을제조하였다. <：비교예 2.비교대상키토산-히알루론산하이드로겔제조> 키토산및히알루론산저장용액 (stock solution)을하기표 2의농도로 준비하였다. 키토산은 lOOmM아세트산 (acetic acid)을이용하여용해시켰다. 히알루론산나트륨은 200mM소듐포스페이트디베이직 도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완충용액에 용해시켰다.이때 40°C의열교반기를이용하여 30분동안용해시킨후,교반을 유지하면서상은이되도록식혀주었다. 준비한키토산과히알루론산용액을 1:1중량비율로흔합하여 650C의 열교반기에서 1시간동안교반하였다.그후，온도를상온으로낮추며 1시간 동안교반하여키토산 -히알루론산하이드로겔을제조하였다. [표 2] <실험예 1.핵산-키토산하이드로겔의물성확인 > 실시예 1,실시예 2，비교예 1및비교예 2의하이드로겔조성물을이용하여 겔화，겔의안정성및용해성여부를확인하였다. 각각의조성물을흔합한후 3일동안투명도와겔화상태를육안으로 관찰하였고，겔화는점탄성여부를，겔의안정성은침전물생성및층분리 여부로확인하였다. 겔의용해성여부는 37.5°C의수용액에실시예 1，실시예 2,비교예 1및비교예 2의하이드로겔조성물을점적하여겔화시킨후온도를 37.5°C로유지하면서， 400rpm으로 5분동안교반하면서겔의용해여부를확인하였고，그결과를표 3， 도 1및도 2에나타내었다ᅳ
[표 3] 상기표 3및도 1을살펴보면，실시예 1-1내지실시예 1-11의온도감옹성 하이드로겔조성물의경우에는핵산및키토산을흔합하고나서 3일이경과 하여도침전물분리및층분리현상이나타나지않으면서도점탄성을유지하고 있는것을알수있다.그러나비교예 1-1내지비교예 1-4와같이본발명의핵산 및키토산의중량비율을벗어나는경우에는침전물이생성되고층분리가 일어나거나점탄성이나타나지않았다. 또한，표 3및도 2의겔의용해성을살펴보면,실시예 1-1내지실시예 1-11의 온도감웅성하이드로겔조성물은 37.5°C에서겔을형성하고,형성된겔이 지속적으로유지되는반면에비교예 1-1내지비교예 1-4는 37.5°C에서겔화되 않거나겔화가되더라도 20초이내에모두용해되는것을알수있었다.
핵산및키토산에추가성분으로히알루론산이포함된실시예 2의경우에도 침전물분리및층분리현상이나타나지않으면서도점탄성을유지하고，겔화 된후지속적인겔올유지하고있는반면에비교예 2-2와같이핵산이포함되지 않은경우에는점탄성을가지며침전물분리및층분리현상이나타나지 않았지만 37.5°C에서겔이형성된후 20초이내에용해되는것을확인하였다 (표 3및도 1참조). 이를통해，본발명의하이드로겔조성물이은도감웅성질을나타내고 안정성이높으며겔화가된후겔의형태를지속적으로유지하는것을알수 있었으며이때，핵산및키토산의중량비율이중요한역할을한다는것을 확안하였다. <실험예 2.온도에따른졸-겔전이 (sol-gel transition)확인 > 실시예 1，실시예 2，비교예 1및비교예 2에서제조한온도감응성하이드로겔 조성물을이용하여졸-겔전이를확인하였다. 졸-겔전이를확인하기위해서레오미터 (rheometer)를이용하였다.이때사용한 측정조건은 PU20,간격 (Gap) 0.5mm, 0.1 Hz, 1%웅력-변형률 (stress strain)로 24°C부터 40°C까지 1°C씩올려주면서 1분간유지시켜 G' (탄성 )및 G" (점성 )의 변화를측정하였다.또한，각각의조성물에온도를가하여 360C전ᅳ후의졸-겔 전이를육안으로관찰하였고그결과를도3에나타내었다ᅳ 도 3에서보여주듯이,실시예 1-3의온도감웅성하이드로겔조성:물이， 온도감웅성하이드로겔이갖는특징인，온도가증가함에따라 G' (탄성)의 감소폭이완만하고 G" (점성)이상승하는 (도 3A)성질을나타내는것을 관찰하였다.또한，실시예 1-3의은도감웅성하이드로겔조성물이 360C미만의 온도에서는졸의형태를따는반면에 36°C가넘으면겔화되는것을 관찰하였다 (도 3B).이러한결과는실시예 1및실시예 2의온도감웅성 하이드로겔조성물모두에서동일하게나타나는것을확인하였다.이를통해본 발명의하이드로겔조성물이온도감응성성질을나타낸다는것을알수있었다.
The present invention provides a temperature sensitive hydrogel composition including a nucleic acid and chitosan. Since the hydrogel has excellent biocompatibility and biostability, and simultaneously has sol-gel phase transition properties depending on temperature changes, the hydrogel is present in a sol state at room temperature and becomes a gel when the hydrogel is injected into the human body or applied on the surface of epithelial skin and the temperature increases. Thus, the temperature-sensitive hydrogel of the present invention can be directly injected into and applied on certain parts requiring treatment and the retention and attaching time of a drug is increased through gelation depending on the temperature so that drug efficacy is sufficiently exhibited. Therefore, it is expected that the temperature-sensitive hydrogel of the present invention can be utilized for various treatments. 청구범위 [청구항 1] 핵산및키토산을포함하며 , 상기핵산및키토산의중량비율이 20:1내지 10000: 1인온도감웅성 하이드로겔조성물. [청구항 2] 제 1항에있어서， 상기핵산및키토산의중량비율이 50:1내지 2000:1인온도감웅성 하이드로겔조성물. [청구항 3] 제 2항에있어서, 상기핵산및키토산의중량비율이 100:1내지 1000:1인온도감웅성 하이드로겔조성물. [청구항4] 제 1항에있어서, 상기핵산의함량이조성물의총중량을기준으로 0.이중량 %내지 3증량 %인것을특징으로하는온도감웅성하이드로겔조성물. [청구항 5] 제 4항에서있어서， 상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의흔합"인것을특징으로 하는온도감웅성하이드로겔조성물.· [청구항 6] 제 1항에있어서, 상기키토산의함량이조성물의총중량을기준으로 lxlO-6중량 %내지 0.15중량 %인것을특징으로하는온도감웅성하이드로겔조성물. [청구항 7] 제 6항에있어서, 상기키토산은분자량이 3kDa내지 l,000kDa인것을특징으로하는 온도감웅성하이드로겔조성물. [청구항 8] 제 1항에있어서, 상기온도감웅성하이드로겔조성물은고분자물질을추가성분으로 포함하는것을특징으로하는온도감웅성하이드로겔조성물. [청구항 9] 제 8항에있어서, 상기고분자물질은히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리감마글루탐산 (poly-Y-glutamic acid),셀를로오스 (cellulose), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid),ᅩ폴리아미노산 (polyamino acid), 알지네이트 (alginate),이들의유도체및이들의조합으로이루어진군 중에서선택되는 1종이상인것을특징으로하는온도감웅성하이드로겔 조성물. [청구항 10] 제 1항내지제 9항중어느한항에기재된온도감웅성하이드로겔 조성물의제조방법으로서, i)핵산저장용액을제조하는단계 ; ii)키토산저장용액을제조하는단계 ;
iii)상기 i)단계의핵산저장용액및상기 ii)단계의키토산저장용액을 핵산및키토산의중량비율이 20:1내지 10000:1이되도록흔합하여 교반하는단계;및 iv)상기 iii)단계의핵산-키토산흔합액을교반하면서상온으로낮추는 단계; 를포함하는것을특징으로하는온도감웅성하이드로겔조성물의제조 방법. [청구항 11] 제 10항에 있어서， 상기제조방법은， i)핵산을완충용액 (buffer)에넣고 60oC내지 70oC에서교반하면서 1시간 내지 2시간동안용해시켜핵산저장용액을제조하는단계; ii)키토산을산성완충용액에용해시켜키토산저장용액을제조하는 단계; iii)상기 i)단계의핵산저장용액및상기 ii)단계의키토산저장용액을 핵산및키토산의중량비율이 20:1내지 10000: 1이되도록흔합하여 55°C 내지 65CC에서 1시간내지 2시간동안교반하는단계 ;및 iv)상기 iii)단계의핵산—키토산흔합액을교반하면서상온으로낮추는 단계; 를포함하는것을특징으로하는온도감응성하이드로겔조성물의제조 방법. [청구항 12] 제 10항에있어서， 상기온도감응성하이드로겔조성물은삼투압이 lOOmOsm내지 500mOsm인것을특징으로하는온도감응성하이드로겔조성물의제조 방법. [청구항 13] 제 10항에있어서， 상기온도감웅성하이드로겔조성물은 pH가 6내지 8인것을특징으로 하는온도감웅성하이드로겔조성물의제조방법 .