TRANSFORMED YEAST PRODUCING NOVEL 1-OCTEN-3-OL, AND PREPARATION METHOD THEREFOR

이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 출원을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예1 : 송이버섯의 Total RNA 분리

대구 인근 가창지역에서 채취한 송이 자실체로부터 Total RNA를 분리 하였다. 송이 자실체를 3 내지 5cm의 작은 조각으로 자른 뒤, 액체 질소를 사용하여 막자 사발로 곱게 마쇄하였다. 마쇄한 자실체를 TRIZol 1 mL 에 완전히 용해시킨 다음 클로로포름(chloroform)을 첨가하였고, 15분간 원심분리하여 RNA를 분리하였다. RNA가 포함된 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필 알코올(Iso-propyl alcohol)을 첨가하여 상온에서 15분간 반응시키고 10분간 12,000rpm에서 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 다음, 상층액을 제거하고 75% 에틸알코올(ethyl alcohol)을 첨가하여 세척한 후 DEPC 처리수(DEPC(diethypyrocarbonate)-treated water)를 첨가하여 Total RNA를 용출, 분리하였고, 그 결과 Total RNA concentration은 992.8ng/㎕로 확인되었다(A260/A280=1.886)(도 1, 첫번째 레인은 DNA marker이며, 2~4레인은 Total RNA를 나타낸다).

*실시예2 : 송이버섯의 cDNA 합성

상기 실시예1에서 수득한 Total RNA와 Accuscript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene)을 사용하여 First strand cDNA를 다음의 방법으로 합성하였다. Total RNA 1 ㎕, RNase-free water 11.7 ㎕, AccuScript RT buffer 2 ㎕, Oligo dT primer 1 ㎕, dNTP mixture 0.8 ㎕를 혼합하여 65℃에서 5분, 다음 상온에서 5분간 반응시킨 후 DTT 100 mM, AccuScript RT 1 ㎕, RNase Block ribonuclease 0.5 ㎕를 더 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 다음 70℃에서 15분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

실시예3: Lipoxygenase-1,2,3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 PCR 산물 제작

상기 실시예2에서 합성, 수득한 cDNA를 주형으로 PrimeSTAR^TM HS Polymerase (TaKaRa)를 이용하고 하기의 프라이머(primer)(표 1) 및 PCR 조건(표 2)을 사용하여 유전자를 증폭시켰다. SC 선택적 배지(SC selectable medium)에서 해당 유전자 및 제한효소를 사용하여 PCR을 수행하였다.

실험결과, 전기영동 사진도를 통하여 각 Lipoxygenase-1 유전자(서열번호 9, 3159 bp), Lipoxygenase-2 유전자(서열번호 10, 3333 bp), Lipoxygenase-3 유전자(서열번호 11, 3855 bp)((도 2의 각 Lane 1,2,3)와 Hydroperoxide lyase(서열번호 12, 1,560 bp, 도 2의 Lane 4) 유전자의 증폭을 확인하였다. 도 2의 전기영동 사진도의 첫번째 레인은 DNA marker으로 Plus DNA Ladder Marker가 사용되었다.실시예4: pGEM™ easy T vector를 이용한 유전자 클로닝상기 실시예3에서 수득한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 PCR 산물을 각 pGEM™ easy T vector (Promega)로 클로닝하기 위해서 Mighty TA-cloning Reagent Set (TaKaRa)을 사용하여 A-tailing 과정을 수행 한 뒤, pGEM™ easy T vector와 4℃에서 overnight하여 ligation 시킨 후, ligation된 vector를 E.coli DH5α competent cells (TaKaRa)에 형질전환하였다. 다음, E.coli는 ampicillin (100 μl/ml), IPTG (0.1mM), X-gal(50 μg/ml)을 첨가한 Luria Broth (LB) medium plate에 도말하여 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양한 뒤, Higene™ Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드에 유전자가 정확하게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전기영동으로 유전자의 크기를 확인한 다음 해당 염기서열 시퀀싱을 수행하였다.

실험 결과, lipoxygenase-1 유전자(도 3(A)), Lipoxygenase-2 유전자(도 3(B)), Lipoxygenase-3 유전자(도 3(C))와 Hydroperoxide lyase 유전자(도 3(D))가 pGEM™ easy T vector 플라스미드에 정확히 삽입된 것을 확인하였다.

실시예5: Yeast expression vector를 이용한 유전자 클로닝

Yeast에서의 유전자 발현을 위한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자가 삽입된 pGEM vector를 각 제한효소 HindIII 와 KpnI으로 37℃에서 반응시켜 절단하였고, Hydroperoxide lyase 유전자가 삽입된 pGEM vector를 각 제한효소 KpnI 와 EcoRI으로 37℃에서 반응시켜 절단하였다. 절단된 유전자들은 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (TaKaRa)으로 정제한 후 정량하였다. 상기 유전자를 발현시키기 위한 미생물 모델로서 Saccharomyces cerevisiae 종을 선택한 후, 효율적인 단백질 발현을 위해 host cell에 적합한 yeast expression vector인 pYES3 벡터(Invitrogen사)를 선택하였다. 본 벡터는 pUc ori 서열이 포함되어 있어 박테리아에서 증폭이 쉽고, 2μ origin 서열이 포함되어 있어 효모에서도 증폭이 가능하다. 또한 이 벡터에는 목적 유전자를 절단하지 않는 제한효소 자리가 multiple cloning site에 있어 벡터에 유전자를 정확하게 삽입할 수 있었다. 강력한 프로모터인 GAL1 프로모터가 있고, T7 프로모터와 CYC1 서열이 있어 유전자의 삽입과 삽입된 서열을 유전자 염기서열 분석으로 정확하게 파악할 수 있다. 그리고 선택 표지 마커인 TRP1 유전자 서열이 존재하여 벡터가 삽입된 효모를 쉽게 선별할 수 있으며, V5 epitope와 6xHis tag 서열이 있어 발현된 타겟 단백질 검출에 용이하다. 종류가 다른 두 유전자를 함께 효모에 형질전환시키기 위하여 pYES3 벡터와 선택 표지 마커가 URA3로 다른 pYES2 벡터를 선택하였다. pYES2 벡터는 pYES3 벡터와 그 외의 특징은 같고 크기는 약 100bp정도 더 크다 (도 4). 선택 표지 마커를 이용하여 각 유전자가 모두 삽입된 효모를 효율적으로 선별할 수 있으므로, 다음의 방법을 이용하여 클로닝을 하였다. Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자는 pYES3/CT vector (Invitrogen)와, Hydroperoxide lyase 유전자는 pYES2/CT vector (Invitrogen)와 4℃에서 overnight ligation 반응을 시켜 E.coli DH5α competent cell(TaKaRa)에 형질전환하였고, ampicillin (100 μl/ml), IPTG (0.1mM), X-gal (50 μg/ml)을 첨가한 Luria Broth (LB) medium plate에 도말하여 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 다음, 선별된 E.coli 로부터 Higene™ Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 사용하여 플라스미드를 추출하였고, 추출한 플라스미드는 각 유전자가 정확하게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전기영동으로 크기를 확인한 다음 염기서열 시퀀싱을 수행하였다. 실험 결과, Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 플라스미드에 정확히 삽입된 것을 확인하였다(도 5). 즉, 도 5(A)의 lane은 m: DNA ladder marker, 1: pYES3/CT, 2: pYES3/CT + Lipoxygenase-1 유전자, 3: pYES3/CT + Lipoxygenase-2 유전자, 4: pYES3/CT + Lipoxygenase-3 유전자이며, 도 5(B)의 lane은 m: DNA ladder marker, 1: pYES2/CT, 2: pYES2/CT + Hydroperoxide lyase 의 전기영동 결과이다.

실시예6: Yeast expression vectors의 INVSc1 효모로의 형질전환

S.C. EasyComp™ Transformation Kit (Invitrogen)를 사용하여 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) competent cell을 제조하였다. 그리고 상기 실시예5에서 수득한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자가 도입된 pYES3/CT vector와 Hydroperoxide lyase가 도입된 pYES2 /CT vector를 각 1 : 1 의 비율로 혼합한 다음 이 벡터들을 S. cerevisiae competent cell(INVSc1)에 형질전환하였다. 그리고 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC medium plate (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements, 2% agar)에 상기 S. cerevisiae competent cell(INVSc1)을 도말하여 30℃에서 2 내지 3일간 배양하였다(도 6(A)). 상기 SC medium 배지는 tryptophan과 uracil이 결실된 최소배지로 TRP1 유전자가 있는 pYES3와 URA3 유전자가 있는 pYES2 벡터가 모두 삽입된 형질전환체 효모를 효율적으로 선별하고 타겟 단백질 발현에 적합하므로 사용되었고, 사용된 SC medium 배지의 조성은 다음 표 3과 같다.

다음, Colony PCR을 수행하여 두 종류의 유전자가 도입된 형질전환 효모를 선별한 결과, Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 Yeast expression vector를 통하여 INVSc1에 형질전환된 것을 확인하였다 (도 6(B)). 각 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 1:1의 비율로 형질전환된 각 효모 KMG 1801, KMG 1802, KMG 1803은 2018년 2월 6일자 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 각 기탁번호 제 KCTC13476BP호, KCTC13477BP호 및 KCTC13478BP호로 기탁되었다.또한, 각각의 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 조합이 형질전환된 효모의 생장을 확인하기 위하여, 해당 배양액의 5mL는 각 배양 후 0,4, 8,12,16,20,24,28,32,36시간마다 효모의 생장곡선 측정을 위한 시료로 사용되었다.측정 결과 KMG 1801(기탁번호 제 KCTC13476BP호, 도 7(A))와 KMG 1802(기탁번호 KCTC 13477BP호, 도 7(B))가 8 내지 12시간 구간에서 빠르게 성장하고, KMG 1803(기탁번호 제KCTC13478BP호, 도 7(C))은 28 내지 32시간 구간에서 빠르게 성장하는 것을 확인할 수 있었다.실시예7: Lipoxygenase과 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모에서 1-octen-3-ol 생합성의 확인

상기 실시예6으로부터 수득한 각 유전자의 조합이 형질전환된 효모에서의 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하기 위해서 tryptophan과 uracil이 결실된 SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 형질전환 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리하여 효모를 모아 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 1.5mM linoleic acid를 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 원심분리로 배양한 효모와 medium을 분리하고 효모에 인산나트륨 용해 완충액(sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5)과 acid-washed glass beads (0.4 - 0.6 mm size)를 첨가하여 bead beater로 lysis한 다음, 원심분리로 균체를 다운시키고 세포용해 상층액을 회수하였다. 다음, 생성된 1-octen-3-ol을 확인하기 위해서 lysates와 배양한 medium을 70℃에서 35분 동안 SPME (solid phase microextraction)에 휘발성 성분을 추출하여 기체 크로마토그래피-질량분석법 (Gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD))로 분석하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석을 위하여 DB-WAX(60m × 250μm × 0.25μm)와 helium carrier gas를 사용하였으며, 컬럼(column)의 온도는 40℃에서 120℃까지 2℃/min의 속도로 높였으며, 120℃에서 240℃까지 20℃/min의 속도로 높였다. Injector의 온도는 250℃로 하였다.

실험 결과, 도 8과 같이 (A) 기질을 첨가하지 않고 배양한 cell의 lysates와 (B) 기질을 첨가하지 않고 배양한 medium에서는 peak가 관찰되지 않았으나, (C) 기질을 첨가하여 배양한 cell의 lysates와 (D) 기질을 첨가하여 배양한 medium 에서는 38.27 min에 1-octen-3-ol의 peak가 확인되었다.

한편, 각각의 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase의 조합에 따른 1-octen-3-ol 생합성에 대한 결과는 표 4와 같다. 표 4에 따르면 송이버섯 자실체에서 발견된 유전자 Lipoxygenase-1, Lipoxygenase-2, Lipoxygenase-3와 Hydroperoxide lyase의 각 조합이 도입된 효모에서 모두 1-octen-3-ol의 생합성 효과가 있었으며, 조합의 종류에 따라 생합성의 정도는 다름을 확인하였다. 또한, 1-octen-3-ol 생합성율(Concentration)은 Lipoxygenase-1을 이용한 경우가 가장 높음이 확인되었다.

실험예1: 기질의 농도와 반응조건에 따른 1-octen-3-ol 생합성의 최적화기질의 농도와 반응조건에 따른 형질전환 효모의 1-octen-3-ol 생합성량을 확인하기 위해서 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 Lipoxygenase-1 와 Hydroperoxide lyase가 형질전환된 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리로 효모를 모아 tryptophan과 uracil이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 적절한 농도의 linoleic acid (0 ~ 0.1 M) 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 또한, 반응조건에 따른 형질전환 효모에서 1-octen-3-ol 생합성량을 확인하기 위해서 전배양한 효모를 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 3mM linoleic acid를 첨가하여 15℃와 30℃에서 각 12, 24, 36, 48시간 동안 배양하였다. 원심분리로 배양한 효모를 모아 인산나트륨 용해 완충액(sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5))과 acid-washed glass beads (0.4 - 0.6 mm size)를 첨가하여 bead beater로 lysis한 다음, 원심분리로 균체를 다운시키고 세포용해 상층액을 회수하였고, 0.1g의 NaCl (단백질 침전을 위함)을 첨가하여 동량의 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 향기물질을 추출하여 기체 크로마토그래피-질량분석법(Gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD))으로 분석하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석을 위하여 DB-WAX(60m × 250μm × 0.25μm)와 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 40℃에서 120℃까지 2℃/min의 속도로 높였으며, 120℃에서 240℃까지 20℃/min의 속도로 높였다. Injector의 온도는 250℃로 하였다. 생합성된 1-octen-3-ol의 농도는 1-octen-3-ol standard (Sigma)와 비교분석 하였다. 실험 결과, (A) Linoleic acid 첨가 농도가 3mM일 때 1-octen-3-ol 생합성량은 약 0.48mg/L로 가장 높았으며, (B) 24시간 동안 30℃ 에서의 1-octen-3-ol의 생합성량은 약 0.35mg/L으로 가장 높았다 (도 9).