METHOD FOR DEFINING STAGES OF DEVELOPMENT OF CYANOBACTERIAL BLOOM

本发明属于水环境治理与蓝藻水华控制技术领域，具体涉及一种蓝藻水华发展各阶段的界定方法。

湖泊富营养化和蓝藻水华发生是一项重大的环境问题，现有的大型浅水湖泊蓝藻水华的控制主要是在蓝藻生物量大的夏季，但蓝藻水华的治理应当从根源起，需要在蓝藻水华暴发时杀藻控藻，也要在蓝藻死亡或生长初期时就采取手段抑制其发展，因此需要界定蓝藻水华发展的各个阶段，按照蓝藻的生长规律在蓝藻水华的各个发展阶段采取不同措施。

目前较为常用的是蓝藻水华发展下沉-休眠-复苏-上浮的四阶段理论，将12-2月界定为下沉休眠期，主导因子是低温、黑暗，3-4月界定为上浮复苏期，主导因子多采用温度、氧、风浪等，4-9月界定为大量生长期，主导因子为物质能量，4-11月为上浮积聚期，主导因子为水文气象。但目前的四阶段理论还是基于研究模型提出，是一种蓝藻水华的成因的假设，各个生长期间的界定方式还比较模糊。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝藻水华发展各阶段的界定方法，将蓝藻水华的发展划分为五个阶段，并提供了基于关键因子和阈值的各阶段甄别方式。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种蓝藻水华发展各阶段的界定方法，包括：将蓝藻水华的发展划分为蓝藻越冬期、复苏期、快速生长期、暴发期和蓝藻衰亡期五个阶段；界定步骤如下：

步骤(1)在湖泊采样点处采集水体上、中、下层水柱混合水样、上覆水和沉积物样本；测定水柱、上覆水和沉积物中藻蓝素、叶绿素a的浓度/含量；分别计算水柱、上覆水和沉积物中藻蓝素/叶绿素a浓度/含量比值；当各采样点沉积物、上覆水、水柱三者中藻蓝素/叶绿素a浓度/含量比值均小于1时，为蓝藻越冬期；

步骤(2)自蓝藻越冬期起，从湖泊采样点采集表层沉积物样本，从表层沉积物样本中提取RNA，测定藻蓝蛋白合成基因PC-IGS、藻毒素合成基因mcyA和伪空胞合成基因gvpC的相对表达量；当基因相对表达量的值同时满足PC-IGS相对表达量>3、mcyA相对表达量>0.03且gvpC相对表达量>0.004时，判定蓝藻进入复苏期；

步骤(3)自蓝藻复苏期起，从湖泊采样点采集完整水柱藻样提取RNA，测定ftsZ基因的 相对表达量；通过室内培养相同水柱藻样中分离出的微囊藻，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，得到此时ftsZ基因相对表达量，作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期；

步骤(4)自蓝藻快速生长期起，监测湖泊各监测点风速，以3.1米/秒作为暴发期的界定阈值，当风速小于3.1米/秒时界定为蓝藻暴发期；

步骤(5)自蓝藻快速生长期起，从湖泊采样点采集完整水柱样本，测定nblA基因相对表达量和溶解性有机质中葡萄糖与中性多糖比值，当nblA基因相对表达量达到2.4，并且水体溶解性葡萄糖/中性多糖的比值大于30％的时候界定蓝藻进入衰亡期。

进一步的，所述步骤(1)还包括，将全湖各采样点沉积物中藻蓝素/叶绿素a含量比值、上覆水藻蓝素/叶绿素a浓度比值、及水柱藻蓝素/叶绿素a浓度比值小于1的点位确定为湖泊蓝藻越冬区域，并根据监测点位的数据，估算和划定区域范围。

所述步骤(1)中，以各采样点沉积物、上覆水、水柱三者中藻蓝素/叶绿素a浓度/含量比值均小于1的最早的一天为蓝藻越冬期的第一天，蓝藻越冬期第一天前后10天内为采取控制措施的窗口期。根据划定的窗口期以及前述估算和划定的越冬区域范围，可以有针对性的在界定的窗口期时间内对划定的区域范围进行蓝藻治理。

进一步的，所述步骤(1)中，水体上层水样指水体表层到水下20cm的水体；水体下层水样指距离底层20cm处的水体；中段为水体中层水样；所述上覆水指沉积物表层水体。

进一步的，所述步骤(2)还包括，根据湖泊不同采样点的三种基因相对表达量高低进行排序，通过空间网格划分和空间插值，对湖泊进行分区，同时满足PC-IGS相对表达量>3、mcyA相对表达量>0.03和gvpC相对表达量>0.004的区域确定为越冬蓝藻的复苏区域。优选采用GIS布设网格，利用Arcgis软件的法进行空间插值和数据储存，空间插值采用反距离权重插值法。

所述步骤(2)中，自蓝藻越冬期起，以同时满足表层沉积物中PC-IGS相对表达量>3、mcyA相对表达量>0.03且gvpC相对表达量>0.004时最早的一天为复苏期第一天，复苏期第一天前后15天内为采取控制措施的窗口期。根据划定的窗口期以及前述估算和划定的复苏区域范围，可以有针对性的在界定的窗口期时间内对划定的区域范围进行蓝藻治理。

进一步的，所述步骤(3)中，将分离取自湖泊的微囊藻群体分若干处理组在不同生长环境中培养，每天取样测量藻细胞的密度变化，获得藻细胞不同生长环境下各生长周期的生长率；生长率计算公式为：μ＝(lnN_t-lnN₀)/t，其中，N_t和N₀分别代表t时刻和初始时刻的细胞密度；培养周期30天，每3天对各处理组的微囊藻进行取样，得到单位细胞中ftsZ基因的相对表达 量。

进一步的，所述步骤(5)中，中性多糖包括核糖，木糖，阿拉伯糖，鼠李糖，岩藻糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖。

进一步的，本发明采用荧光定量PCR方法测定基因的相对表达量。

本发明针对蓝藻全年生长规律提供了一种蓝藻水华发展各阶段的界定方法，通过野外周年调查和监测，甄别了蓝藻水华全过程不同阶段的关键参数和阈值，确定了各阶段实施控藻除藻技术的窗口期，基于本发明的方法可以实现蓝藻水华发展阶段的界定，从而实现各阶段针对性的除藻、控藻处理，最终实现全过程控藻。

图1是太湖不同湖区底泥藻蓝素与叶绿素含量比值的周年变化；

图2是太湖不同湖区上覆水蓝素色素与叶绿素含量比值的周年变化；

图3是太湖不同湖区水体藻蓝素浓度与叶绿素浓度比值的周年变化；

图4是太湖采样点布设方式；

图5是太湖表层沉积物中PC-IGS基因相对表达量；

图6是太湖表层沉积物中gvpC基因相对表达量周年变化；

图7是太湖表层沉积物中mcyA基因相对表达量周年变化；

图8是太湖采样点水柱中ftsz基因表达量与微囊藻生长速率的关系；

图9是太湖蓝藻原位生长率；

图10是太湖藻胆体降解蛋白基因相对表达量的周年变化规律；

图11为太湖溶解性有机质中葡萄糖与中性多糖比值的周年变化图。

实施例以太湖为例，具体说明本发明蓝藻水华发展各阶段的界定方法。

步骤(1)在太湖采样点处采集水体上、中、下层水柱混合水样、上覆水和沉积物样本；

在秋季末至春季初，根据气象条件一般选择在每年的11月至3月之间，在各采样点处采集样本。

采样频率为每半个月采集一次样品，采集水体上、中、下层混合水样、上覆水和沉积物表层15cm深样本，沉积物样品用管径大于15cm的柱状采样器采集。

将采集的样品带回实验室分析测定沉积物、上覆水和水柱中叶绿素a的和藻蓝素含量/浓度，并分别计算水柱、上覆水和沉积物中藻蓝素/叶绿素a浓度/含量比值。

如图1所示，沉积物藻蓝素色素与叶绿素含量比值(PC/Chla)代表了沉积物中蓝藻在总藻中的比重，太湖不同湖区沉积物PC/Chla周年调查结果表明，自9月份到下一年的3月份，该比值相对稳定，在所有湖区中都小于1。4月份随着温度的上升，沉积物蓝藻活性增强，开始大量生长，沉积物PC/Chla开始快速上升。

如图2所示为太湖不同湖区(采样点)上覆水藻蓝素浓度与叶绿素浓度比值的周年变化。

越冬期间，水柱中蓝藻多分布于水体下层，上覆水中藻蓝素浓度与叶绿素浓度比值的周年变化规律表明在9月份到下一年4月份，该比值在所有湖区的都约小于1，5月份由于温度升高，上覆水中蓝藻开始快速生长，沉积物蓝藻也开始复苏，导致上覆水中藻蓝素浓度与叶绿素浓度的比值迅速升高并达到一个峰值。

如图3所示为太湖不同湖区(采样点)水体藻蓝素浓度与叶绿素浓度比值的周年变化

太湖水体中的浮游藻类群落在周年内会发生演替，冬季硅藻占优势，春季绿藻占优势，因此整水柱中藻蓝素浓度与叶绿素浓度的比值在10月到下一年的4月，都比较低，在调查的所有湖区中该比值都小于1。相对于其它类群的藻类，蓝藻更适宜于在温度较高的水体中生长，5月份，蓝藻进入快速增长期，水柱中藻蓝素浓度与叶绿素浓度的比值快速增加。

综合上述三项指标界定蓝藻越冬期自9月开始；为了有效消除越冬蓝藻，确定越冬期第一天前后减去10天确定为采取控制措施的窗口期。

将全湖各采样点沉积物中藻蓝素含量/沉积物叶绿素a含量、上覆水藻蓝素浓度/叶绿素a浓度、及水柱藻蓝素浓度/叶绿素a浓度小于1的点位确定为湖泊蓝藻越冬区域，并根据监测点位的数据，估算和划定区域范围。

步骤(2)全太湖范围内布设如图4所示的8个样点，采样频率为每月采集一次表层底泥样品。将采集的底泥样品迅速混合均匀，加入RNAlater保护液，迅速放入液氮中保存，带回实验室保存在-70℃中直到RNA提取。

底泥中RNA采用FastRNA Pro Soil Direct Kit试剂盒提取，操作步骤如下：

称取0.5-1g沉积物加入到2mL紫色的裂解管E(Lysing Matrix E，包含直径为1.2mm，0.074mm和4mm的玻璃珠)中，再向裂解管E中加入1mL土壤裂解液，反复颠倒几次，使沉积物和玻璃珠悬浮在裂解液中。将装有沉积物和裂解液的裂解管E放置于Fast Prep-24样品处理仪器中，设置Fast Prep-24样品处理仪器参数，6m/s，40s，使沉积物破碎。然后在室温下，14,000×g离心5min。将得到的上清液转移至新的离心管中，再加入750μL苯酚：氯仿(1：1)到新的离心管中，涡旋10s。在室温下温浴5min，使得核蛋白质分解增加RNA纯度。然后 在4℃条件下，14,000×g离心5min。离心之后在不破坏中间物质的情况下，小心的将上清液转移至新的离心管中。向新的离心管中加入200μL去除RNA抑制剂的溶液，颠倒5次使充分混合，然后在室温下，14000×g离心5min。再次将上清夜转移至新的离心管中，加入660μL的冷冻的100％的异丙醇至样品中，颠倒5次至完全混合之后放在-20℃下过夜。在4℃，14000g离心15min之后将上清液倒掉。用500μL冷冻的70％乙醇清洗沉淀物，将70％的乙醇倒掉之后将沉淀物在室温下风干5min，将得到的RNA悬浮在200μL的DEPC水中。以上步骤得到的RNA要进行清洗，向含有RNA的DEPC水中加入600μL RNAMATRIX结合液和10μL RNAMATRIX悬浮液，混匀之后在室温下温浴5min，离心将RNAMATRIX绑定的RNA沉淀，将上清液倒掉。向RNAMATRIX绑定的RNA沉淀中加入500μL RNAMATRIX清洗溶液，继续离心去除上清液，再次离心将残留的清洗液去除，然后在室温下干燥5min。加入50μL DEPC水通过涡旋使得RNAMATRIX悬浮，离心之后将含有RNA的上清液加入到新的无RNA酶的离心管中。

提取底泥中RNA后采用Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录。在约400ngRNA样品中，加入1μLAnchored-oligo(dT)和2μL随机六聚物引物，400ngRNA和适量PCR级别的水，使总体积为13μL，混合之后在PCR仪中65℃温浴10min。温浴之后再依次加入4μL transcriptor reverse transcriptase reaction缓冲液、0.5μLRNA抑制剂、2μL脱氧核苷酸混合剂和0.5μL transcriptor reverse transcriptase，混匀之后放在PCR仪上反应，设置PCR仪的程序为25℃，10min、55℃，30min以及85℃，5min。将反应完之后的PCR管立即放置冰上，将得到的cDNA保存在-20℃中备用。

将反应完之后的PCR管立即放置冰上，将得到的cDNA保存在-20℃中备用。针对各个目的基因所设计引物为：

PC-IGS基因

188F5’-GCTACTTCGACCGCGCC-3’；

254R 5’-TCCTACGGTTTAATTGAGACTAGCC-3’；

mcyA基因

mcyA-F 5’-AAAATTAAAAGCCGTATCAAA-3’；

mcyA-R 5’-AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT-3’)；

gvpC基因

gvpC-F 5’-TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3’；

gvpC-R 5’-TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3’)；

将以16S rRNA为引物的cDNA模板稀释10倍，其它的cDNA模板不稀释。

扩增程序如下：qRT-RCR反应体系为25μL，其中含12.5μL 2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2μM引物，1μL模板，无RNA酶的水10.5μL。PCR反应在replex⁴(Eppendorf)荧光定量PCR仪上完成。扩增程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环。PCR完成后，导出相应的阈值循环数值(Threshold cycle value，简写Ct值，定义为荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，目的基因的拷贝数与Ct值呈负相关)。基因表达量用反应的Ct值来评估，PCR过程中以16S rRNA为阳性内对照基因来校正PCR模板的细胞拷贝数从而消除组间加样量。

荧光定量PCR扩增：荧光定量PCR扩增曲线分为荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期三个阶段，荧光定量PCR结束后可以直接导出Ct值。

基因的相对表达量用2^-ΔΔCt表示，ΔΔCt计算公式如下：ΔΔCt＝(Ct_目标基因-Ct_16S rRNA)_野外-(Ct_目标基因-Ct_16S rRNA)_对照。

基因的相对表达量测定完成后，综合分析这三项指标，判定越冬蓝藻的复苏窗口期。其具体方法是：以时间为横坐标，基因的相对表达量的值为纵坐标绘制曲线，根据曲线综合分析三个与蓝藻的活性恢复和上浮有直接关系的基因的表达参数变化，当底泥水体中蓝藻的藻蓝蛋白转录间隔区基因的相对表达量PC-IGS>3、藻毒素基因(mcyA)的表达量>0.03和伪空胞基因的表达量(gvpC)>0.004时，综合分析判定底泥越冬蓝藻进入复苏期。选取复苏期阈值上限(同时满足PC-IGS>3、mcyA＞0.03、gvpC＞0.004的日期中最早的一天)减去15天确定为采取措施的种源清除的窗口期。

藻蓝蛋白基因(PC-IGS)、藻毒素基因(mcyA)和伪空胞基因(gvpC)的表达都始于冬季并在春季达到最大值，但是这三个基因的表达在时间上也存在差异。伪空胞基因的表达早于藻蓝蛋白基因，是由于随着伪空胞基因表达量的升高，蓝藻迅速合成伪空胞，从而带动蓝藻从底泥上浮到水体表面，进而使得蓝藻获得适宜的生长条件和营养盐，这时藻蓝蛋白基因才开始迅速表达。

图5是太湖表层底泥中PC-IGS基因相对表达量。藻蓝蛋白转录间隔区基因(PC-IGS)相对表达量从1月份到5月份逐渐升高，并在5月迅速达到最大值，贯穿整个越冬复苏期。当形成水华后，藻蓝蛋白基因的表达才逐渐下降，这表明当微囊藻进入水华期，可以上浮至湖面获得最大光照，无需继续合成更多的藻蓝蛋白。

图6是太湖表层底泥gvpC基因相对表达量周年变化，蓝藻在越冬复苏阶段，伪空胞基因转录水平逐渐升高并在3月份达到最大值，但是在蓝藻生物量增加以及上浮阶段，伪空胞基因表达水平逐渐降低。这表明：伪空胞基因(gvpC)的表达及伪空胞的形成是微囊藻摆脱休眠状态、重新获得浮力的一个标志性的转变；当藻细胞重新恢复成正常细胞后即不需要伪空胞基因(gvpC)的持续表达。

图7是太湖表层底泥mcyA基因相对表达量周年变化，微囊藻毒素基因(mcyA)的表达在每年的2月或3月达到最大值，而且在个别点位如N4和N5等mcyA的表达与藻蓝蛋白转录间隔区基因和伪空胞基因具有显著相关性，随着藻蓝蛋白转录间隔区基因和伪空胞基因表达的增加而增加。

结合图5、图6和图7看，太湖各湖区底泥微囊藻藻蓝蛋白转录间隔区基因(PC-IGS)、伪空胞合成基因(gvpC)和藻毒素合成基因(mcyA)三个关键基因的几乎表达都从11月份开始上升，在3月份达到最大值，然后从4月份有下降趋势。从基因表达上来看，可以将蓝藻生活史进行界定。

步骤(3)在太湖不同采样点采集完整水柱的藻样，混合过滤，浓缩后快速转移至无RNase的冻存管中放入液氮中带回实验室，-70℃保存。采样时间为2017年3月到6月。并提取各样品RNA，对RNA进行反转录得到微囊藻cDNA。

RNA提取的步骤：将低温保存的GF/C滤膜，转移到裂解管B(Lysing Matrix B，玻璃珠直径0.1mm)中，加入500μL Buffer RLT，放置于Fast Prep-24样品处理仪器中。设置Fast Prep-24样品处理仪器参数，6m/s，35s。击打破碎之后，立即取出裂解管并放入冰上，4℃，12000rpm条件下离心10s，紧接着将上清液转移至无RNase 2mL离心管中。然后根据RNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书操作。

RNA反转录：反转录采用的是Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，根据从不同样品中提取的RNA浓度，计算400ng所需体积。按照试剂盒进行反转录：加入1μLAnchored-oligo(dT)和2μL随机六聚物引物，400ngRNA和适量PCR级别的水，使总体积为13μL，混合之后在PCR仪中65℃温浴10min。温浴之后再依次加入4μL transcriptor reverse transcriptase reaction缓冲液、0.5μLRNA抑制剂、2μL脱氧核苷酸混合剂和0.5μL transcriptor reverse transcriptase，混匀之后放在PCR仪上反应，设置PCR仪的程序为25℃，10min、55℃，30min以及85℃，5min。将反应完之后的PCR管立即放置冰上，将得到的cDNA保存在-20℃中备用。

利用ftsZ基因和微囊藻16Sr RNA序列的引物扩增步骤(1)得到的微囊藻cDNA；

对各样品进行RNA提取和反转录后，利用表1中的ftsZ和16S rRNA引物扩增经反转录得到的微囊藻cDNA。PCR反应体系为：2mmol/L dNTP mix 5μL，25mmol/L Mg²⁺2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.5μL，高保真DNA聚合酶(TaKaRa,Janpan)(1U/μL)1μL，10×PCR buffer 5μL，cDNA 3μL，去离子水补足至50μL。

表1 扩增微囊藻ftsZ和16S rRNA基因的引物

用荧光定量PCR扩增每个样品的ftsZ和16SrRNA基因，以16Sr RNA为管家基因，ftsZ为目的基因，推算单位细胞中ftsZ基因的相对表达量；

利用采集的完整水柱的藻样分离出的微囊藻，通过室内培养实验，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，得到此时ftsZ基因相对表达量，作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。

分离取自太湖的微囊藻群体，以4.0×10⁵cell/L为初始密度，将微囊藻分别培养在低温、低光、营养盐限制，以及适宜的生长环境中(表2)，每处理组设置三个平行，每天取样用MUSE细胞计数器测量藻细胞的密度变化，获得藻细胞不同生长环境下各生长周期的生长率。生长率计算公式为：μ＝(lnN_t-lnN₀)/t(N_t和N₀分别代表t时刻和初始时刻的细胞密度)。

培养周期30天，每3天对各处理组的微囊藻进行取样。根据上述方法得到单位细胞中ftsZ基因的相对表达量。

最后对各样品的生长率μ和对应的ftsZ基因相对表达量进行线性回归，得到微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程Y＝0.059+0.093X(如图8所示)。

表2室内培养微囊藻的不同生长环境条件

根据微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，获得太湖不同湖区取样点的微囊藻原位生长率。

根据太湖不同湖区微囊藻3月到5月原位生长速率的变化规律可以看出(图9)，4月初，微囊藻的生长速率开始增加，一直持续到5月份，随后生长开始下降，因此认为微囊藻的快速生长期的生长大约为0.13d^-1。该值作为蓝藻快速生长期的阈值，判定蓝藻快速生长期为4月初—5月上旬。根据图8可以得到此时ftsZ基因相对表达量为0.5。该值作为蓝藻快速生长期的阈值。

步骤(4)蓝藻的上浮和聚集主要受风速的影响，本发明蓝藻暴发期界定沿用现有技术关于不同气象水文条件下不同藻类在水体中垂直分布的研究讨论(孔繁翔等.2009)，当风速大于3.1米/秒时，蓝藻主要分布在水面0.5m以下的水柱中，而当风速小于3.1米/秒时，大部分蓝藻会漂浮在表层水面，形成蓝藻水华，因此将风速3.1米/秒作为水华暴发期的阈值。

步骤(5)首先制定原位采样计划和实验准备；采用的微囊藻为微囊藻Microcystis aeruginosa7806，该藻种由中科院典型培养物种保藏委员会淡水藻种库(FACHB)提供。

在湖泊布设采样点，全年逐月从湖泊原位取样，获取采样点处完整水柱样本；

2016年1月至2016年12月每月采集太湖北部梅梁湾完整水柱的藻样，在现场立即混合，用GF/C滤膜过滤100mL水样，快速转移至无RNase的冻存管中放入液氮中带回实验室，放在-70℃中保存直到RNA提取。

对采集的水柱样本和处于对数生长期的室内纯培养微囊藻样品进行RNA提取纯化，并分别进行RNA反转录得到cDNA；

室内微囊藻在最佳条件的培养：

将铜绿微囊藻藻种接入BG-11培养基，在光照培养箱中培养。培养条件为：光强40μE·(m²·s)^-1，温度25℃，光暗比12h:12h，每天定时摇晃3次；

将采集的水柱样本和处于对数生长期的室内纯培养微囊藻样品转移至无RNase、并经过液氮冷却的2mL离心管中，藻细胞经液氮反复冻融3次以破碎细胞。

采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取藻细胞中的RNA。按试剂盒说明提取RNA，测定RNA浓度。

采用QIAGEN公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。

根据RNA浓度计算1μg RNA所需的体积。按照试剂盒进行逆转录：加入2μL gDNA  Wipeout Buffer，1μg RNA和适量的RNase-free H2O，总体积14μL。颠倒混匀后至于PCR仪中，42℃下温浴2min以去除基因组DNA。然后向其中加入1μL Reverse-transcription master mix，4μL Quantiscript RT Buffer及1μL RT Primer Mix，混合后至于PCR仪中42℃温浴15min，然后95℃灭活3min。

逆转录后的cDNA稀释10倍作为荧光定量PCR模板。

采用荧光定量PCR方法测定微囊藻藻胆体降解蛋白nblA基因的相对表达量；

设计扩增引物，如表3所示：

表3荧光定量PCR引物

荧光定量采用QIAGEN公司的荧光定量试剂盒，反应体系设为25μL，体系内具体成分为：1μL cDNA，正向引物和反向引物各0.5μL，12.5μLReaction mix，10.5μL RNase-free water。反应程序设为：95℃3min，95℃15s/55℃45s/72℃30s(40个循环)。基因表达量用反应的Ct值来评估。

以得到的水柱样本cDNA作为荧光定量PCR的模板扩增微囊藻藻胆体降解蛋白nblA基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{野外目的基因}；扩增微囊藻16srRNA内参基因；PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{野外同一样本16s}；两者差值Ct_{野外目的基因}-Ct_{野外同一样本16s}为校正后的细胞拷贝数，记作ΔCt_{野外目的基因}；

以得到的室内纯培养微囊藻样品cDNA作为荧光定量PCR的模板，扩增微囊藻藻胆体降解蛋白nblA基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{室内目的基因}；扩增微囊藻16srRNA内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{室内同一样本16s}；两者差值Ct_{室内目的基因}-Ct_{室内同一样本16s}为校正后的细胞拷贝数，记作ΔCt_{室内目的基因}；

基因的相对表达量用2^-ΔΔCt表示，ΔΔCt计算公式如下：

ΔΔCt＝ΔCt_{野外目的基因}-ΔCt_{室内目的基因}。

测定采集的水柱样本中水体溶解性葡萄糖/中性多糖的比值；

将采集的水柱样本用0.45μm滤芯进行预过滤。然后采用美国Millipore公司生产的Pellicon 切向流超滤系统，超滤膜的分子量截留为lkDa(相当于孔径为1nm)。

使用总有机碳分析仪(Shimadzu TOC-V CPN,岛津)测定样本高分子量溶解性有机碳。冷冻干燥得到的高分子量溶解性有机物粉末，用2M三氟乙酸100℃消解24h，加入新配制的硼氢化钠(用氨水配制)，于40℃下保温1.5小时，使糖(或糖胺)完全还原为糖醇，最后加入冰醋酸以中止过量的硼氢化钠继续作用。混合标准糖样同法操作还原。取样品0.4mL，加入0.2mL甲基咪唑和1mL醋酸酐，在室温下乙酰化反应10分钟。加入5mL蒸馏水以降解过量的醋酸酐。用流动自来水冷却至室温后，加入1mL二氯甲烷，使之充分混合，静置10分钟，吸去上层水相后，再加入5mL蒸馏水，同上法操作，弃水层，重复操作三次。在所获下层二氯甲烷相中加入适量的无水硫酸钠脱水干燥后，离心，用氮吹仪吹干二氯甲烷，用正己烷置换，可用于测定乙酰化的单糖。气相色谱质谱仪测定条件：毛细管柱DB-225(15m×0.25mm,0.25μm)；柱温：初温180℃，以4℃升至220℃，并在220℃保温30min。进样量2μL。载气为氩气，流速为2mL/min。糖的标准样品为，核糖，木糖，阿拉伯糖，鼠李糖，岩藻糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖。

计算得到的太湖溶解性有机质中葡萄糖与中性多糖比值的周年变化图如图11所示。

以时间为横坐标，nblA基因相对表达量的值为纵坐标绘制曲线，根据nblA基因的相对表达量随时间变化的曲线，根据曲线确定微囊藻衰亡窗口期。

nblA是编码藻胆体降解蛋白的基因，藻胆体降解蛋白能降解藻胆体，影响藻细胞正常捕获光能。太湖野外蓝藻与室内最佳培养条件微囊藻nblA基因表达量相对比值的周年变化规律表明，该比值在冬春季水平较低，约为0.8左右，而在夏季末期8月份开始增加，在10月份达到峰值，表明此时蓝藻藻胆体降解蛋白基因的表达量最高，藻开始快速衰亡，随后nblA基因的相对表达量开始降低(图10)。

综合nblA基因相对表达量和溶解性有机质中葡萄糖与中性多糖比值，确定以nblA基因相对表达量2.4为阈值，当nblA基因相对表达量达到2.4，并且水体溶解性葡萄糖/中性多糖的比值大于30％的时候为蓝藻进入衰亡期的第一天。