White carrot rapid tissue culture regeneration system
附图说明 图1是白色胡萝卜‘米莱克’种子发芽。 图2是白色胡萝卜‘米莱克’的愈伤诱导。M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9分别对应表2中9种培养基。 图3是白色胡萝卜‘米莱克’愈伤分化的胚状体。A、B、C、D愈伤诱导和分化阶段的培养基分别为M1+B5、M2+B5、M2+MS和M4+MS的胚状体分化图。 图4是白色胡萝卜‘米莱克’的再生植株。 技术领域 本发明涉及植物组培技术领域，特别是指白色胡萝卜快速组培再生体系。 具体实施方式 实施例 植物材料 以白色胡萝卜‘米莱克’作为试验材料，选取健康饱满的‘米莱克’种子进行试验。 种子消毒催芽与无菌苗的获得 种子先经75％酒精消毒1遍，接着用40％NaClO冲洗1遍，随后置于40％NaClO浸泡45分钟进行消毒。消毒后的种子用无菌水清洗后，平铺于B5培养基上进行催芽，每个培养皿上铺30粒种子，重复3次。 培养皿放置在光照培养箱中，于25℃条件下黑暗培养7～10天，光培养1天，最终统计种子发芽率获得无菌苗，并拍照记录。 白色胡萝卜‘米莱克’种子经消毒后发芽情况如图1，发芽率如表1。种子在催芽过程中均未发生污染，生长良好，符合获得无菌苗的要求。‘米莱克’的发芽率均在80％以上，最高为87％，平均发芽率为83％。 表1白色胡萝卜‘米莱克’种子发芽率(三个重复) 不同激素配比培养基对白色胡萝卜愈伤的诱导 表2所示为9种不同激素配比的愈伤诱导培养基。将白色胡萝卜外植体接种到9种培养基中，接种40天后观察愈伤生长情况，统计愈伤诱导率。 图2所示为愈伤生长形态。 表3所示为愈伤颜色、愈伤硬度、诱导率、分化率。 9种培养基中除M5外，均能诱导出健康的愈伤组织(图2)，且M1、M2、M3、M4、M6、M7和M8培养基中的愈伤组织诱导率均为100％，M9培养基中的愈伤组织诱导率为88％(表3)。将培养基M1、M3、M7和M2、M4、M8分成两组进行观察，结果显示，随着2，4-D浓度的增加，愈伤组织的硬度逐渐降低，愈伤逐渐变软；将培养基M3、M4、M5和M7、M8、M9分成两组进行观察，发现随着6-BA浓度的增加，愈伤组织硬度逐渐增加，黄色加深。从愈伤状态来看，M1、M2、M3三种培养基上诱导的愈伤组织更饱满，大小和硬度适中，颜色偏白，且愈伤诱导率为100％。综合以上结果表明，白色胡萝卜‘米莱克’下胚轴在低浓度的2，4-D和6-BA配比下愈伤诱导情况更好。 表2不同激素配比培养基 表3白色胡萝卜‘米莱克’愈伤诱导情况 不同培养基白色胡萝卜愈伤的胚状体分化 将9种浓度激素培养的愈伤组织分别接种到的B5培养基(20个)和MS培养基(20个)上进行分化，培养60天后，统计愈伤分化率。结果显示，M1、M2和M4三种培养基中的愈伤组织成功分化出了胚状体。其中，M2培养基中的愈伤组织在分化阶段分化效果最好，在此处理下以MS培养基作为分化培养基的愈伤分化率最高，为90％，且分化出胚状体数量最多，胚状体的生长状态最好。图3中A、B、C、D愈伤诱导和分化阶段的培养基分别为M1+B5、M2+B5、M2+MS和M4+MS的胚状体分化图。 在M2培养基，即添加了0.5mg/L 2，4-D+1mg/L 6-BA的B5培养基中，愈伤组织诱导效果最好且分化率最高。 同时可以看出，与B5培养基相比，M1、M2和M4培养基中的愈伤在MS培养基中的愈伤组织分化率更高，表明MS培养基更适合作为‘米莱克’愈伤组织分化阶段的培养基。 白色胡萝卜组织培养植株的再生 将愈伤组织分化出的胚状体进行光照培养，100％的胚状体均能生根并正常生长(图4A)。待胚状体形成根系并长出子叶时，转入组培瓶中壮苗；2周左右观察，植株直立，均能正常发育(图4B)。 综上所述，本发明以白色胡萝卜‘米莱克’为材料，建立了白色胡萝卜快速组培再生技术体系。该体系以白色胡萝卜下胚轴为外植体，成功诱导出愈伤组织并分化出胚状体，进而得到白色胡萝卜再生植株。最适合愈伤诱导的培养基及激素浓度及种类为：B5培养基+0.5mg/L 2，4-D+1mg/L 6-BA，诱导率为100％。在此基础上，白色胡萝卜‘米莱克’的最适分化培养基为MS培养基，分化率为90％。对进一步开展白色胡萝卜的遗传改良和应用基础研究工作具有重要价值。 以上结合具体实施例，对本发明技术方案的具体实施方式进行了进一步描述，此具体实施方案是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。以上所述的具体实施方案，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的技术构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通技术人员对本技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。 背景技术 胡萝卜是伞形科二年生根菜类蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培，是我国重要的蔬菜作物。胡萝卜是植物组织培养研究中的经典材料，其根、子叶和下胚轴均可作为外植体进行再生培养。植物再生是遗传转化体系构建的基础，建立快速白色胡萝卜的再生体系可以完善胡萝卜的组织培养体系，为构建丰富的胡萝卜遗传转化体系奠定基础，进而应用于胡萝卜功能基因组学研究和品种改良等。 胡萝卜肉质根具有丰富的颜色，主要分为紫色和非紫色，非紫色又可以进一步分为橙色、黄色、红色和白色。 胡萝卜作为植物组织培养中的模式植物之一，有良好的组织培养和遗传转化基础。随着胡萝卜组织培养和遗传转化技术的发展，胡萝卜在基因功能分析、遗传育种和品质改良等方面已经取得了较多的进展。目前胡萝卜遗传转化涉及的材料主要为橙色胡萝卜，而关于白色胡萝卜组织培养方面的研究鲜有报道。 由于白色胡萝卜肉质根颜色为白色，在研究胡萝卜肉质根着色机制，以及作为通过基因方法创制不同颜色胡萝卜的起始材料等方面，均具有独天得厚的优势。鉴于胡萝卜组织培养及遗传转化对基因型有较强的依赖性，不同颜色胡萝卜的组织培养及遗传转化条件仍有待建立和进一步优化。 本发明以白色品种胡萝卜品种‘米莱克’的下胚轴作为外植体，以植物生长调节剂2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)的不同浓度配比为变量，优化白色胡萝卜品种快速再生条件，建立快速的白色胡萝卜组培再生体系。 发明内容 本发明的目的是提供一种白色胡萝卜品种的快速组培再生体系，提高白色胡萝卜品种的再生效率。 为实现上述目的，本发明提供了如下方案： 本发明提供一种白色胡萝卜品种的快速组培再生体系，包括以下步骤： 步骤1)白色胡萝卜的种子催芽 将浸泡好的白色胡萝卜‘米莱克’种子先经75％酒精消毒1遍，接着用40％NaClO冲洗1遍，随后置于40％NaClO浸泡45分钟进行消毒。 步骤2)白色胡萝卜无菌苗的获得 消毒后的白色胡萝卜‘米莱克’种子用无菌水清洗后，平铺于B5培养基上进行催芽。培养皿放置在光照培养箱中，于黑暗条件下25℃培养7～10天，25℃光培养1天。 步骤3)白色胡萝卜愈伤的诱导 将上述步骤2中获得的无菌苗下胚轴作为外植体，剪成相同大小约3～5毫米的小段，接种到含有9种不同6-BA和2，4-D配比的愈伤诱导培养基上。每个培养基接种30个下胚轴，每个处理重复2次，培养40天后，统计愈伤诱导率。 步骤4)白色胡萝卜愈伤的分化 从上述步骤3获得的愈伤中挑选40个生长旺盛的愈伤组织，分别接种在不添加任何激素的B5培养基和MS培养基上进行分化。每种培养基分别接种20个愈伤组织，于黑暗条件(25℃)下培养，30天更新一次分化培养基。分化历时共60天，记录60天内白色胡萝卜愈伤组织的分化情况，最终对愈伤组织的分化率进行统计分析。 步骤5)生根培养 将上述步骤4中愈伤组织分化出的胚状体置于光照条件(25℃)下生长，待再生植株长出子叶并形成根系时，转入组培瓶中继续培养。在组培瓶生长2周左右，观察再生植株生长状况。 本发明公开了以下技术效果： 本发明建立了一种白色胡萝卜品种的快速组培再生体系，白色胡萝卜种子消毒先经75％酒精消毒1遍，接着用40％NaClO冲洗1遍，随后置于40％NaClO浸泡45分钟；以白色胡萝卜无菌苗的下胚轴作为外植体，再生培养基采用B5培养基，激素浓度及种类为0.5mg/L2，4-D和1.0mg/L 6-BA。本发明提供的白色胡萝卜品种快速组培再生体系能够快速获得白色胡萝卜再生植株，为进一步利用基因工程，改良胡萝卜品种和开展胡萝卜基础应用研究奠定了基础。 The invention discloses a rapid tissue culture regeneration system for white carrots, and belongs to the technical field of plant tissue culture. The method is characterized in that the technical system can be used for rapidly obtaining calluses and tissue culture seedlings of white carrots, and the requirements of white carrot application basic research and carrot character improvement in genetic engineering are met. The technical system comprises a white carrot seed disinfection method, aseptic seedling acquisition, an explant inoculation method, culture conditions, culture medium use, hormone concentration ratio and the like. The white carrot seeds are firstly disinfected by 75% alcohol for one time, then washed by 40% NaClO for one time, and then soaked in 40% NaClO for 45 minutes. A regeneration culture medium adopts a B5 culture medium, and hormone concentration and types are 0.5 mg/L 2, 4-D and 1.0 mg/L 6-BA. According to the technical system, the callus and tissue culture seedlings of the white carrots can be rapidly obtained. 1.一种白色胡萝卜快速组培再生体系，其特征在于，包括以下步骤： 1)种子预处理：将白色胡萝卜种子用水浸泡10小时，除去漂在上面的杂物及发育不良种子，预处理结束后用移液器移除水分； 2)振荡消毒：种子先经75％酒精消毒1遍，接着用40％NaClO冲洗1遍，随后置于40％NaClO浸泡45分钟； 3)接种：白色胡萝卜种子消毒完成后，将消毒好的种子置于已紫外消毒好的工作台上；用移液器移除消毒液，然后用灭菌好的蒸馏水进行清洗，洗到蒸馏水为无色为止；用移液器移除多余水分，将种子接种于事先准备好的B5培养基中；接种好的培养皿盖合后，沿皿盖边缘及时用封口膜封住以防污染； 4)暗培养和光培养：将接种好白色胡萝卜种子的培养皿放置在培养箱中，于黑暗条件下25℃培养7～10天；暗培养完成后，移到光培箱中培养，25℃培养1天。培养期间每隔2天，检测是否感菌，及时移除或转接； 5)外植体分离培养及愈伤诱导：以下胚轴为外植体，将其剪成相同大小约3～5毫米的小段，接种于培养基中进行愈伤诱导。培养基采用B5培养基，激素浓度及种类为0.5mg/L 2，4-D和1.0mg/L 6-BA。每个培养基接种30个下胚轴，放置于25℃培养箱，黑暗环境下培养40天。 6)胚状体分化：将诱导的愈伤组织接种于不添加任何激素的MS培养基中进行分化，放入培养箱后于黑暗环境下培养，温度为25℃。培养60天，在第30天更新一次培养基； 7)再生植株生长：愈伤组织分化出胚状体后，将其接种于MS培养基中，置于光培箱中培养，温度为25℃；待胚状体长出子叶并形成根系时，转入组培瓶中，在组培瓶生长2周左右，形成完整植株。 2.根据权利要求1所述的一种白色胡萝卜快速组培再生体系，其特征在于，步骤2)中对白色胡萝卜种子消毒，先经75％酒精消毒1遍，接着用40％NaClO冲洗1遍，随后置于40％NaClO浸泡45分钟。 3.根据权利要求1所述的一种白色胡萝卜快速组培再生体系，其特征在于，步骤5)中所述的再生培养基采用B5培养基，激素浓度及种类为0.5mg/L 2，4-D和1.0mg/L 6-BA。