Rapamycin-loaded brain-targeted platelet-derived extracellular vesicle and application thereof
附图说明 图1为本发明的血小板衍生胞外囊泡的透射电镜图； 图2为本发明的血小板衍生胞外囊泡的粒径分布图； 图3为本发明的血小板衍生胞外囊泡的zeta电位图； 图4为本发明的血小板衍生胞外囊泡、血小板的Western Blot结果图； 图5为本发明的脑靶向递送系统负载雷帕霉素紫外吸收图； 图6为本发明的脑靶向递送系统负载雷帕霉素的载药量图； 图7为本发明的脑靶向载药递送系统的粒径变化图； 图8为本发明的脑靶向递送系统对神经功能障碍小鼠的活体检测图； 图9为本发明的脑靶向递送系统对神经功能障碍小鼠脑部靶向图； 图10为本发明的脑靶向递送系统治疗神经功能障碍小鼠的开放场测试图； 图11为本发明的脑靶向递送系统治疗神经功能障碍小鼠的水迷宫测试图； 图12为本发明的脑靶向递送系统治疗神经功能障碍小鼠的新物体识别测试图； 图13为本发明的脑靶向递送系统治疗神经功能障碍小鼠的脑部炎性因子表达图； 图14为本发明的脑靶向递送系统治疗神经功能障碍小鼠的Aβ蛋白免疫荧光图； 图15为本发明的脑靶向递送系统治疗神经功能障碍小鼠的小胶质细胞形态分析图。 技术领域 本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡及其应用。 具体实施方式 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。 4周龄的KM小鼠购自苏州大学实验动物中心。所有动物实验均经苏州大学实验动物中心和动物福利审查委员会批准，符合相关伦理道德标准。 实施例1血小板的提取 从健康KM小鼠眼底静脉丛取新鲜血液，100×g离心15min后提取上清血小板血浆(PRP)。颗粒状PRP重悬在含有前列腺素E1(2μM)和乙二胺四乙酸(EDTA)(5mM)的磷酸盐缓冲液中以防止活化血小板。之后再次将血小板血浆在800×g离心20分钟以获得浓缩血小板。将浓缩血小板在室温下储存，以在重新悬浮后进一步使用。 实施例2脑靶向递送系统的制备 浓缩血小板与凝血酶(2U mL-1)共孵育并在室温下低速摇匀30分钟以活化血小板，之后在800×g离心20分钟以获得血小板衍生胞外囊泡上清液。将上清液以100000×g离心70min，获得的含囊泡颗粒在PBS中洗涤后，再次用100000×g离心70min，收集纯化囊泡颗粒即为脑靶向递送系统，并于200μL灭菌PBS中重悬。每次离心均在4℃下进行。通过透射电镜观察其形貌，如图1所示，血小板衍生胞外囊泡大小约为100-150nm。通过动态光散射检测，结果如图2和图3所示，血小板衍生胞外囊泡的直径小于200nm，zeta电位小于0mV。此外，血小板衍生胞外囊泡保留来自血小板的粘附分子，包括CD41和P-选择素如图4所示，它们可以与激活的小胶质细胞和星形胶质细胞结合。 实施例3载药脑靶向递送系统的定性分析 不溶性雷帕霉素首先溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，配制成20mg/mL的母液，并与血小板衍生胞外囊泡孵育。用高速离心再次分离装载雷帕霉素的血小板衍生胞外囊泡。利用紫外吸收仪测定雷帕霉素负载的脑靶向递送系统的紫外吸收峰，结果如图5所示，雷帕霉素在吸收光谱中的特征吸收峰表明雷帕霉素成功装载到血小板衍生胞外囊泡上。 利用高效液相色谱(HPLC)测定雷帕霉素的装载量，结果如图6所示，在雷帕霉素投料量为100μg mL-1时，载药率(装载/添加雷帕霉素)约为11.73％。通过动态光散射检测载药后递送系统粒径大小，结果如图7所示，载药后递送系统的直径仍小于200nm，且与未载药的递送系统无显著性差异。 实施例4脑靶向递送系统的靶向性分析 KM小鼠经由LPS诱导构建急性肺损伤小鼠模型，将荧光探针DiR标记的脑靶向递送系统DiR-PEVs以鼻内给药的方式给予小鼠。未处理的健康小鼠作为对照。在实验设计的时间点使用活体荧光成像系统进行成像。结果如图8所示，观察到与健康小鼠和游离荧光探针DiR处理的肺炎小鼠相比，脑靶向递送系统DiR-PEVs在肺炎小鼠的大脑中显示出最强的荧光信号，在健康小鼠的大脑中呈现较弱的荧光信号，这是因为肺炎造成脑部环境紊乱，脑靶向递送系统可对激活的小胶质细胞和星形胶质细胞进行靶向。此外，脑内血小板衍生胞外囊泡在12h时达到最大富集，在脑中的保留时间明显长于对照组。体外成像也显示了肺炎小鼠大脑中血小板衍生胞外囊泡的大量积聚，结果如图9所示。因此，本发明的脑靶向递送系统可对脑部神经系统相关疾病的病理进程进行检测。 实施例5脑靶向递送系统的治疗效果分析 评估载药的脑靶向递送系统(负载雷帕霉素的血小板衍生胞外囊泡RAPA-PEVs)对患有肺炎引起的神经系统疾病的小鼠的治疗效果。在脂多糖诱导建立急性肺损伤小鼠模型后，小鼠接受游离雷帕霉素(1mg/kg)和RAPA-PEVs(等同1mg/kg雷帕霉素)鼻内给药，每两天一次，共4次。未处理小鼠、未治疗小鼠和单独用血小板衍生胞外囊泡或雷帕霉素治疗的小鼠作为对照。第30天进行行为学测试。开放场实验结果如图10所示，RAPA-PEVs治疗可有效缓解未治疗小鼠由肺炎引起的神经障碍导致的运动活性降低。水迷宫测试结果如图11所示，与未处理的小鼠相比，鼻内给药RAPA-PEVs显著提高了小鼠进入目标象限的频率，并减少了到达目标平台所需的时间，而游泳速度没有差异。此外，在新物体识别测试中，结果如图12所示，接受RAPA-PEVs的小鼠显著缓解了肺炎后新物体偏好指数的下降。单独使用游离雷帕霉素或血小板衍生胞外囊泡的治疗效果较差或有限。这些结果表明，RAPA-PEVs鼻内给药可以显著挽救肺炎引起的行为障碍。 通过ELISA测试了脑组织匀浆液中炎性因子IL-1β，IL-6和TNF-α的表达，结果如图13所示，RAPA-PEVs给药能在第30天时恢复脑组织匀浆液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。此外，对脑组织进行切片荧光染色，结果如图14所示，RAPA-PEVs处理后小鼠大脑中Aβ蛋白表达降低。小胶质细胞形态分析如图15所示，小胶质细胞分支长度和数量增加，表明小胶质细胞恢复了稳态。说明RAPA-PEVs治疗可有效缓解肺炎后脑内小胶质细胞和功能障碍。这些结果表明本发明的脑靶向递送系统可增强治疗脑部神经炎症及神经系统相关疾病。 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。 背景技术 由于人口老龄化加速，神经系统疾病在世界范围内变得越来越突出，这大大增加了医疗成本。神经系统疾病是中枢神经系统(CNS)的疾病，其特征是细胞的进行性退化和神经功能的缺陷。 雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)是一种新型的大环内酯类免疫抑制剂，具有高效免疫抑制作用。该药物临床应用主要在两个方面：预防排异反应和冠状动脉支架涂层。近年来大量研究发现RAPA对很多疾病有治疗作用，尤其是在脑神经保护方面。 然而，由于神经系统疾病大多属于慢性疾病，均需长期药物治疗，各研究组在肯定RAPA疗效的同时也发现其在治疗过程中对模型动物造成了不少的不良反应：RAPA长期使用存在过度免疫抑制，抑制实验动物正常发育，同时也会产生骨髓抑制和肺部感染等问题；并且，RAPA的副作用表现为剂量依赖性增加，再加血脑屏障(BBB)的存在使药物到达脑内的浓度大大降低，导致普遍RAPA制剂用于神经系统疾病时疗效较差。 目前，研究人员为了减轻不良反应，增加雷帕霉素在脑内的浓度，提出了不同的方案。张圆圆以乳化聚合法制备了吐温80修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯雷帕霉素纳米粒，经体内验证发现该靶向制剂对癫痫的治疗作用优于普通非靶向制剂，对实验动物的体重增长抑制明显减轻，但对神经细胞的保护并无明显改善；郭桥利用MOF材料的多孔性、搭载效率高、毒性低等优势，制备了一种纳米铁金属有机框架搭载雷帕霉素，该载体能够通过血脑屏障，搭载药物治疗缺血性脑卒中，但该载体与吐温80修饰的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒一样，都会不同程度地引起机体的排异反应，限制了这些药物在临床上的应用。目前还有通过鼻内给药和控制血脑屏障的紧密连接来将药物输送到中枢神经系统(CNS)。但大多靶向药物的辅料对鼻粘膜组织以及黏膜纤毛有毒性作用，长期经鼻腔给药会造成不可逆的鼻粘膜损伤；有些药物还可能有中枢神经系统毒性，会造成神经系统的损伤。同时，雷帕霉素极微溶于水，而鼻内给药的限制是低剂量/体积，特别是化合物具有较低的水溶解度时，难以配制。高分子量的药物则吸收急剧下降，生物利用度低。因此，仍需要进一步开发递送系统用于载药以及靶向脑部治疗。 发明内容 为解决上述问题，本发明提供一种装载雷帕霉素的脑靶向递送系统，无需使用异源或是化学类物质作为递送载体，生物安全性高。通过鼻内给药的方式将高浓度药物递送到脑部，是无创的给药途径，并可靶向活化的脑部胶质细胞和星形细胞，减少药物到非靶向部位的传递，避免了全身稀释效应和毒副作用，促使大脑快速和更高的摄取。因此装载治疗性物质或检测性物质的血小板衍生胞外囊泡可以将药物成功递送到脑部，进行脑部神经系统疾病的治疗和诊断。 本发明的第一个目的是提供一种装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡，通过雷帕霉素与血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡共孵育得到。 进一步地，所述血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡通过以下步骤制备得到：提取血小板，与含有血小板激活剂的缓冲液孵育使血小板活化，将活化后的血小板分离制备成囊泡。 进一步地，所述血小板激活剂为凝血酶。 进一步地，所述提取血小板为，将血液分散于含血小板抗凝剂的缓冲液中，离心纯化血小板。 进一步地，所述装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡的直径小于200nm，更优地，小于150nm。 进一步地，所述血小板来自自体或同种异体。 本发明的第二个目的是提供上述装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡在制备神经炎症或神经系统疾病的治疗制剂中的应用。 进一步地，给药方式为鼻腔给药。 进一步地，所述治疗制剂可以靶向结合脑部活化的胶质细胞和星形细胞，恢复脑部免疫稳态。 进一步地，所述治疗制剂用于缓解脑部神经功能障碍。 本发明的第三个目的是提供一种检测神经炎症或神经系统疾病的制剂，所述制剂经鼻腔给药，制剂中包括血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡，且血小板衍生胞外囊泡装载检测性物质。 进一步地，所述检测性物质包括但不限于探针、显影剂等。 本发明的有益效果： (1)传统的鼻腔给药为了减轻对粘膜的损伤，一般会对吸收的药物进行微粉化，而本发明提供了一种新的脑靶向递药系统，无需对装载的药物进行额外处理，制备得到的载药囊泡直径小于200nm，zeta电位小于0mV，通过鼻内给药的方式将载体及负载的药物递送至脑部病灶处。 (2)血小板是人体内固有的细胞之一，具有许多独特的优点，可以很容易地从病人身上或者血库获得，并且表现出极好的生物相容性。而来源于血小板的血小板衍生胞外囊泡不仅表现出良好的生物相容性，还可跨越生物屏障，可承载药物，并且机体对囊泡的免疫反应更低。 (3)本发明通过眼眶取血获取小鼠的血液并从中提取血小板。血小板与雷帕霉素结合，并通过活化获取雷帕霉素-血小板衍生胞外囊泡。通过鼻内给药载药的脑靶向递送系统，可跨越血脑屏障将药物输送至脑部，挽救星形胶质细胞和小胶质细胞功能障碍，平息脑部的炎性环境，恢复免疫稳态，有效缓解肺炎后的神经功能障碍，改善小鼠的行为认知和记忆障碍。该脑靶向递送系统可发展应用于多种脑部神经系统相关疾病治疗。而血小板与细胞膜荧光探针DiR结合，并通过活化获取DiR-血小板衍生胞外囊泡，在健康小鼠和重症肺炎小鼠脑部观测到不同强度的荧光信号，因而本发明可检测脑部神经系统相关疾病的病理进程。 The invention discloses a rapamycin-loaded brain-targeted platelet-derived extracellular vesicle and application thereof. The rapamycin-loaded brain-targeted platelet-derived extracellular vesicle is obtained by co-incubation of rapamycin and platelet-derived extracellular vesicles generated by activation of platelets. Therapeutic drugs or detection substances can be loaded on the platelet-derived extracellular vesicles, and the drugs are delivered to brain lesions in an intranasal drug delivery mode, so that neuroinflammation or nervous system related diseases are treated and detected. Through verification, by utilizing the delivery system to deliver rapamycin, dysfunctions of astrocytes and microglial cells of the brain are rescued, behavioral cognition and dysmnesia are improved, a whole-body drug dilution effect and first-pass metabolism are avoided, and toxic and side effects are reduced. 1.一种装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡，其特征在于：通过雷帕霉素与血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡共孵育得到。 2.根据权利要求1所述的装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡，其特征在于，所述血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡通过以下步骤制备得到：提取血小板，与含有血小板激活剂的缓冲液孵育使血小板活化，将活化后的血小板分离，制备成囊泡。 3.根据权利要求2所述的装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡，其特征在于：所述提取血小板为，将血液分散于含血小板抗凝剂的缓冲液中，离心纯化血小板。 4.根据权利要求1所述的装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡，其特征在于：所述装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡的直径小于200nm。 5.根据权利要求1所述的装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡，其特征在于：所述血小板来自自体或同种异体。 6.权利要求1-5任一项所述的装载雷帕霉素的脑靶向血小板衍生胞外囊泡在制备神经炎症或神经系统疾病的治疗制剂中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：给药方式为鼻腔给药。 8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述治疗制剂靶向结合脑部活化的胶质细胞和星形细胞，恢复脑部胶质细胞和星形细胞稳态。 9.一种检测神经炎症或神经系统疾病的制剂，其特征在于：所述制剂经鼻腔给药，制剂中包括血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡，且血小板衍生胞外囊泡装载检测性物质。 10.血小板活化产生的血小板衍生胞外囊泡在制备神经炎症或神经系统疾病检测制剂中的应用。