Bacillus velezensis strains and uses thereof

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下述实施例所用培养基如下：

PDA培养基：准确称取马铃薯淀粉5g、葡萄糖20g、琼脂15g，适量蒸馏水溶解，后定容至1L。

LB肉汤培养基：准确称量胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、葡萄糖1g，适量蒸馏水溶解，后定容至1L。

LB高糖培养基：准确称量胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、蔗糖30g、葡萄糖15g，适量蒸馏水溶解，后定容至1L。

LB琼脂培养基：准确称量胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、葡萄糖1g、琼脂15g，适量蒸馏水溶解，后定容至1L。

LB琼脂高糖培养基：准确称量胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、琼脂15g、蔗糖30g、葡萄糖15g，适量蒸馏水溶解，后定容至1L。

水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)已经公开，详见文献1(吴希阳气、罗路云等,沼泽红假单胞菌Atp2蛋白的原核表达及稻瘟病菌的互作蛋白初步筛选，中国生物防治学报，2020，3：424-428)。

胶孢炭疽(Colletotrichum gloeosporioides)，已经公开，详见文献2(曾泉水、满益龙等,辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立，植物保护，2019，4：156-184)。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌的诱变、分离

本实施例中，诱变分离得到贝莱斯芽孢杆菌。包括如下步骤：

1.1、贝莱斯芽孢杆菌辐照诱变实验

1.1.1从之前培养的野生出发菌株(由清华大学应用化学研究所提供)中挑取一环，接种至装液量为50mL的LB肉汤培养基三角瓶中，37℃，180rpm摇瓶培养16h，此为一级活化液。

1.1.2将本实施例中步骤1.1.1得到的一级活化种子液按4％(2mL)的接种量接入LB高糖培养基中(250mL的三角瓶装液量为50mL)，在37℃，180rpm的条件下摇床振荡培养，在菌株的培养对数期取样，取样的菌液用生理盐水进行稀释，调节菌悬液浓度为10⁷CFU/mL左右。

1.1.3无菌操作吸取本实施例中步骤1.1.2的菌悬液分装于10mL灭菌离心管中，做好标记，使用不同剂量的⁶⁰Coγ-射线进行诱变处理，每个灭菌离心管写明诱变剂量，每个剂量辐照两管，并留两管不辐照的菌液作为对照(即CK)。

1.2、诱变后菌落计数及致死率计算

1.2.1用移液枪吸取1mL辐照后菌液于9mL生理盐水中充分混匀，制成1:10的样品匀液。用无菌移液枪吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使混合均匀，制成1:100的样品匀液。重复上述操作，制备10倍系列稀释样品匀液。

1.2.2选取10^-3～10^-6四个稀释梯度的样品匀液，吸取1mL本实施例中步骤1.2.1的样品匀液于无菌平板培养皿内，每个稀释度做两个平板培养皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平板培养皿内作空白对照。及时将15～20mL冷却至45℃左右的LB琼脂培养基倾注至各平板培养皿，并转动平板培养皿使其混合均匀。琼脂凝固后，将平板翻转，37℃培养24h后进行计数。

1.2.3计算出CK的活菌数及不同诱变剂量的活菌数，以CK为对照，计算出不同诱变剂量的存活率和致死率，致死率见表1。

存活率＝诱变后菌落总数/CK菌落总数致死率＝1-存活率

1.3、诱变后单菌落纯化培养

用接种环挑取致死率在80％～90％左右的平板培养皿中单菌落，用走“之”字型的方式接种至LB琼脂斜面培养基上，每支LB琼脂斜面培养基上接种一个纯化菌落，获得纯化菌株共144株，编号为A01-A144。

重复上述操作，将接好的斜面放37℃培养24h后拿出放冰箱保存备用。

表1为根据致死率筛选辐照诱变贝莱斯芽孢杆菌适宜条件

从表1可知，贝莱斯芽孢杆菌的适宜辐照诱变条件：辐照源为⁶⁰Co-γ射线，剂量为1826Gy，剂量率为92Gy/h，经该剂量和剂量率辐照后的菌株，即为本申请筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌菌株。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌的鉴定

本实施例中，对实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括以下步骤：

2.1形态学特征和生理生化鉴定

将实施例1中步骤1.3得到的纯培养物划线于LB培养基平板上，28℃培养48h后，菌落为淡黄色，隆起，表面褶皱，不透明，干燥，边缘不整齐，有芽孢。在显微镜下观察，其菌体形态呈短杆状，见图7。

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠2001)进行革兰氏染色试验、硝酸盐还原、VP试验、脲酶、精氨酸双水解酶等进行菌株生理生化特性测定，结果见表2。

从表2可知，菌株BAC81712为革兰氏阳性菌，精氨酸双水解酶、β-半乳糖苷酶、接触酶、柠檬酸生长、脲酶、氧化酶、明胶水解、硝酸盐还原、VP试验反应等为阳性，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、甲基红反应、产生H₂S、产生吲哚等测试反应为阴性。

表2

注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。

2.2Biolog鉴定

采用BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株BAC81712进行鉴定，所有仪器耗材皆为Biolog公司产品，结果见表3。

从表3可知，菌株BAC81712符合贝莱斯芽孢杆菌的特性。

表3 Biolog GEN Ⅲ(化学敏感实验)

注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。

2.3分子生物鉴定

本发明贝莱斯芽孢杆菌BAC81712送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序如下：

AGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCG(SEQ ID No.1)

测序所得序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上进行同源比对分析，结果表明该纯培养物与Bacillus velezensis(基因库登陆号：FJ713021.1)的相似性达100％，在基于16s rDNA序列构建的系统发育树中，该菌株与Bacillus velezensis(基因库登陆号：FJ713021.1)聚在一枝上。综合，菌株形态学、生理生化鉴定、化学敏感性鉴定，诱变菌株中编号为A17的菌株即为本申请的贝莱斯芽孢杆菌(Bcillus velezensis BAC81712)，于2022年6月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022954。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌的对炭疽病菌、稻瘟病菌的抑制作用

本实施例中，采用实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌针对稻瘟病菌和炭疽病菌进行抑菌实验，包括如下步骤：

4.1贝莱斯芽孢杆菌抑制稻瘟病菌和炭疽病菌效果初筛

4.1.1从斜面保藏的CK菌株和诱变后的菌株分别接种一环单菌落于装有50mL LB高糖培养基的三角瓶中，37℃，180rpm摇瓶培养24h后测量其吸光值，计算贝莱斯芽孢杆菌浓度，用LB高糖培养基将所有菌株浓度调至接近。后用无菌生理盐水进行稀释，将菌液浓度调至合适值。

4.1.2将水稻稻瘟病菌和蔬菜炭疽病菌用点接法点接在含有PDA培养基的平板中间，28℃培养，直至长满平板。

4.1.3抑菌试验(采用平板对峙法)：

用打孔器在长好的病原菌边缘打大小相同的菌饼接在新的培养基中间(炭疽病菌接在LB琼脂高糖培养基里，稻瘟病菌接在PDA培养基里)，在距平板中央2cm处的两端放置滤纸片，分别吸取10μL菌悬液滴于滤纸片上，一端为未诱变的贝莱斯芽孢杆菌即CK，一端为诱变后的贝莱斯芽孢杆菌。28℃培养，5天后用游标卡尺测量抑菌效果，每个菌株做两个平行。

4.1.4抑菌试验(采用四点法)：

与本实施例中步骤4.1.3操作相似，但是是用十字交叉法在距平板中心2cm处的四个点放置滤纸片，吸取10μL菌悬液滴于滤纸片上(一个板上接同一株菌)，28℃培养5天，测量病原菌直径，以CK为对照，病原菌直径小于CK的即抑菌效果比CK好。每个菌株做3个平行，计算抑菌提高率。

抑菌提高率＝(诱变菌株侧抑菌带距离/诱变菌株菌落生长半径-CK侧抑菌带距离/CK菌株菌落生长半径)×100％

备注：

如图1为本实施例初筛中贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟病菌的抑菌效果图。

从图1可知，通过平板对峙法初筛，编号为A12、A14、A17、A18的贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟病菌的抑菌效果较出发菌株CK提高。

如图2为本实施例初筛中贝莱斯芽孢杆菌BAC81712对炭疽病菌的抑菌效果图。

从图2可知，通过平板对峙法初筛，编号为A11、A13、A17、A20的贝莱斯芽孢杆菌对炭疽病菌的抑菌效果较出发菌株CK提高。

4.2、贝莱斯芽孢杆菌抑制稻瘟病菌和炭疽病菌效果复筛

4.2.1从斜面保藏的CK菌株和本实施例中步骤4.1初筛后单菌落分别接种一环于装有50mL LB高糖培养基的三角瓶中，37℃，180rpm摇瓶培养16h后测量其吸光值，计算贝莱斯芽孢杆菌浓度，用LB高糖培养基将所有菌株的菌液浓度调至接近。

4.2.2将水稻稻瘟病菌和蔬菜炭疽病菌用点接法点接在含有PDA培养基平板中间，28℃培养，直至长满平板。

4.2.3用打孔器在长好的病原菌边缘打大小相同的菌饼接在新的含有PDA培养基平板中间，28℃培养一天后，用十字交叉法在距病原菌菌饼中央2.5cm处的四端放置滤纸片，吸取同一菌株的10μL菌悬液分别滴于四个滤纸片，每株菌做三个平行(空白为滤纸片上接10μL无菌水)。28℃培养，5天后用游标卡尺测量植物病原菌生长直径，计算抑制率。

抑制率＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100％

备注：

如图3为本实施例中复筛中贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟病菌的抑菌效果图。

从图3可知，出发菌株CK和编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌都具有显著对稻瘟病菌的抑菌效果，且编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟病菌的抑菌效果高于CK。

如图4为本实施例中复筛中贝莱斯芽孢杆菌对炭疽病菌的抑菌效果图。

从图4可知，出发菌株CK和编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌都具有显著对炭疽病菌的抑菌效果，且编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌对炭疽病菌的抑菌效果高于CK。

图5为本实施例中抑菌复筛中贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟病菌和炭疽病菌的抑制率柱状图(四点法)。

从图5可知，在初筛的11株诱变菌株中，与出发菌株CK相比，编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟病菌和炭疽病菌的抑制效果均显著增加。

从图1、2、3和4可知，相比出发菌种，贝莱斯芽孢杆菌BAC81712(即图中A17)对稻瘟病菌的抑制率提高了2.1％，对炭疽病菌的抑制率提高了6.5％，且该活性在六代内遗传稳定。

实施例5贝莱斯芽孢杆菌的遗传稳定性

本实施例中，进行贝莱斯芽孢杆菌的遗传稳定性研究，包括如下：

1)传代培养:分别从CK、编号为A04、A12、A17、A18的贝莱斯芽孢杆菌的初代斜面挑取一环单菌落于LB肉汤培养基中，37℃,180r/min摇瓶培养24h后，分别从三角瓶中蘸取一环于LB培养皿中划线培养使其出现单菌落，后分别挑取单菌落于LB肉汤培养基37℃,180r/min摇瓶培养24h，如此揺瓶-平板-揺瓶循环培养，后分别挑取培养至第五代和第六代的单菌落于试管斜面划线培养。

2)解淀粉芽孢杆菌菌液的制备：分别挑取第一代、第五代、第六代的CK、A04、A12、A17、A18于装有50mL LB高糖的三角瓶中，37℃,180r/min摇瓶培养16h，后测量其吸光值，计算解淀粉芽孢杆菌浓度，用LB高糖培养基将其浓度调至接近。

3)病原菌的培养：将水稻稻瘟病菌和辣椒炭疽病菌用点接法点接在含有PDA培养基平板中间，28℃培养，直至长满平板。

4)遗传稳定性验证试验：用打孔器在长好的病原菌边缘打大小相同的菌饼接在新的PDA培养基平板中间，28℃培养一天后，用十字交叉法在距病原菌菌饼中央2.5cm处的四端放置滤纸片，分别吸取10μL菌悬液滴于滤纸片上(一个板上接同一株菌)，每株菌做三个平行(空白为滤纸片上接10μL无菌水)。28℃培养，待空白对照病原菌长满平板后用游标卡尺测量抑菌效果。计算抑制率。

抑制率＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100％

图6为本实施例中贝莱斯芽孢杆菌拮抗植物病原菌效果的遗传稳定性。

从图6可知，诱变菌株A17直至第5、6代，其对稻瘟病菌和炭疽病菌的抑制效果均和第1代一致，且诱变菌株A17的第1代、第5代、第6代的对稻瘟病菌和炭疽病菌的抑制效果均显著高于出发菌株CK。

实施例6贝莱斯芽孢杆菌BAC81712发酵液的抑菌实验

1)将CK(对照菌落)、A17的一个单菌落(处理菌落)分别接入LB高糖培养基后放入摇床，37℃,180rpm培养18h。

2)分别将上述培养获得的菌液摇匀，于600nm下测量其吸光值，当OD值高于2.5，调节菌群密度为1×10⁹cfu/mL后，分别吸取5mL菌液接入装有50mL LB高糖培养基的250mL锥形瓶中，37℃,180rpm摇床发酵培养24h。

3)24h后将2)中发酵液分别分装于10mL离心管，10000rpm离心10min，分别取上清液先后过0.45μm有机膜(天津津腾实验设备有限公司)和0.22μm细胞专用过滤膜(美国Millipore公司)，获得无菌发酵上清液。

4)用打孔器分别在长满的炭疽病菌平板和稻瘟病菌平板打孔直径6mm的圆饼，用镊子将打孔后的菌饼放于含有PDA培养基平板中心，用四点法在据菌饼中心2.5cm的四周放置牛津杯，每个牛津杯里面加200μL无菌发酵上清液，作为空白对照的牛津杯中加入200μL无菌水。每个菌株各做三个平行。上述平板置于28℃培养，待空白对照病原菌长满平板后用游标卡尺测量各个平板病原菌直径。计算抑制率。

抑制率＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100％

如图7为本实施例中贝莱斯芽孢杆菌的发酵上清液对稻瘟病菌的抑菌效果图。

从图7可知，出发菌株CK和编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌的发酵上清液都具有显著对稻瘟病菌的抑菌效果。

如图8为本实施例中贝莱斯芽孢杆菌的发酵上清液对炭疽病菌的抑菌效果图。

从图8可知，出发菌株CK和编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌的发酵上清液都具有显著对炭疽病菌的抑菌效果。如图9为本实施例中贝莱斯芽孢杆菌的发酵上清液对稻瘟病菌和炭疽病菌的抑菌率柱状图。其中，左边为稻瘟病菌(magnapothe grisea)，右边为炭疽病菌(bacillus anthracis)。

从图9可知，编号为A17的贝莱斯芽孢杆菌对炭疽病菌和稻瘟病菌的抑菌效果均高于CK组。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌BAC81712对稻瘟病菌的抑制率可达到64.6％，相比于自然界中的出发菌贝莱斯芽孢杆菌，提高了2.1％；对炭疽病菌的抑制率可达到58.7％，相比于自然界中的出发菌贝莱斯芽孢杆菌，提高了6.5％。本发明的贝莱斯芽孢杆菌BAC81712对植物病原菌病拮抗作用的遗传学稳定，遗传第5代、第6代的菌株对稻瘟病菌和炭疽病菌的抑制效果与1代一致，且显著高于出发菌株。本发明的贝莱斯芽孢杆菌BAC81712的发酵上清液也具有对植物病原菌的抑菌效果，其菌液和发酵液均可后续用于水稻和蔬菜的生物防治，因此在农业生产上有良好的应用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。