METHOD FOR ACTIVATING A NATURAL KILLER CELL BY ADJUSTING THE EXPRESSION OF THE SOCS2 GENE

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 배양

<1-1> 세포주 배양

미국 세포주 은행(ATCC)에서 구입한 표 1의 세포주를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

상기에서 배양된 세포주를 트립신-EDTA(Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid, Invitrogen, 미국)를 처리하여 75-세포 배양 플라스크에서 떼어낸 후, 혈청이 함유된 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화 시킨 다음, 원심분리하여 침전시켰다. 상등액을 제거한 뒤 각 세포주에 따른 배양 배지를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 살아있는 세포를 트리판블루 색소배제법(trypan blue dye exclusion test)으로 염색한 다음 헤모사이토미터를 이용하여 계수한 후, 100 mm 디쉬에 5×10⁵ 세포/플라스크로 계대 배양하였다.

표 1

* IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco, 미국): 10% FBS(Gibco) 함유

* RPMI-1640: 10% FBS 함유

* EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium, Gibco): 0.01 mg/ml bovine insulin 및 10% FBS 함유

* F-12K: 10% FBS 함유

* AMEM(Alpha Minimum Essential medium, Gibco), 2 mM L-glutamine(Gibco), 1.5 g/L sodium bicarbonate(Gibco), 0.2 mM inositol(Gibco), 0.1 mM 2-mercaptoethanol(Gibco), 0.02 mM folic acid(Gibco), 100-200 U/ml recombinant IL-2(Gibco), 12.5% horse serum(Gibco) 및 12.5% FBS 함유

* DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco): 10% FBS 함유

<1-2> 1차 세포(Primary cell) 배양

산모의 제대혈로부터 초대배양 자연 살해 세포(primary natural killer cell) 및 분화된 자연 살해 세포(mature natural killer cell)를 채취하였다. 상기 자연 살해 세포는 산모의 제대혈로부터 Histopaque-1077 (Sigma, 미국)를 이용하여 제대혈 내의 세포들을 얻어낸 후, human NK Cell Isolation Kit(Miltenyi, 독일)를 이용하여 자연살해세포를 분리하였다. 방법을 통해 채취되었고, 원심분리를 거쳐 영하 70℃에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다. 초대배양 자연 살해 세포 및 분화된 자연 살해 세포의 채취는 서면으로 된 사전동의 후에 이루어졌다. 본 기관의 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)는 연구 목적으로 이러한 환자에게서 생화학적 물질과 정보를 수집하는 것을 승인하였다. 상기와 같이 채취된 초대배양 자연 살해 세포 및 분화된 자연 살해 세포를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하여 하기 실험에 사용하였다.

실시예 2. SOCS2 shRNA를 발현하는 바이러스의 제조

Sigma 사(미국)로부터 socs2(suppressor of cytokine signaling 2)(서열번호 1)에 대한 shRNA(서열번호 2: 5'-CCGGCGCATTCAGACTACCTACTAACTCGAGTTAGTAGGTAGTCTGAATGCGTTTTTG-3')를 발현하는 pLKO.1-SOCS2 shRNA 벡터(TRCN0000057058) 및 음성 대조군 shRNA(서열번호 3: 5'-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT-3')를 발현하는 pLKO.1-무표적 shRNA 대조군 벡터(SHC002)를 구입하였다. 상기 벡터, third-generation packaging system(pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G) 및 HEK293 T 세포주를 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 SOCS2 shRNA 또는 대조군 shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 제조하였다. 렌티바이러스를 함유하는 HEK293T 세포 배양액을 4°C에서 90분 동안 50,000 g로 울트라원심분리(ultracentrifugation)시켜 농축시켰다. 이후, 상기 렌티바이러스 농축액을 Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit(clontech, 미국)을 사용하여 역가를 결정하였다.

표 2

<3-1-2> 웨스턴 블롯

또한, 각 자연 살해 세포를 RIPA 용해완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% SDS, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일, 탈인산화효소 억제제 칵테일)을 사용하여 용해시킨 뒤, 총 세포 용해물에 존재하는 단백질의 농도를 BCA Protein Assay Kit(Pierce, 미국)를 이용하여 결정하였다. 각각 30 μg의 단백질 시료를 10 또는 12% SDS-PAGE gel을 이용하여 분리한 후, Immobilon-P 막(Millipore Corporation, 미국)으로 전달시켰다. 이후 상기 트랜스퍼 막을 5% 스킴밀크로 30분간 블로킹 한 후, 1차 항체로서 항-SOCS2 항체(Santa Cruz, 미국)를 4°C에서 하루 동안 처리하였다. 일차 항체가 처리된 막에 HRP-컨쥬게이트 항-래빗 이차 항체(Santa Cruz, 미국)를 붙이고, 이에 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore Corporation)을 첨가하여 준 후, X-ray film에 감광하여 확인하였다. 이때, 정량적 대조군으로서 항-GAPDH 1차 항체(Santa Cruz, 미국)를 이용하여 GAPDH의 발현량을 상기와 같은 방법으로 함께 확인하였다. 상기 확인 결과를 도 1b에 나타내었다.

그 결과, 도 1b에서 나타난 바와 같이 거의 탐지되지 않던 SOCS2 단백질이 8일 이상 분화시킨 자연 살해 세포에서 탐지되었다. 이로부터 분화가 진행됨에 따라 socs2의 mRNA 및 단백질 발현이 증가하며, 특히 8일째부터 급격히 증가하는 것을 알 수 있었다.

<3-2> 자연 살해 세포에서 IL-15에 의한 SCOS2 발현 유도 확인

자연 살해 세포의 분화는 IL-15(Interleukin 15) 사이토카인에 의해 이루어진다. 본 발명자들은 도 2a 및 도 2b에서 확인한 자연 살해 세포의 분화에 따른 SOCS2의 발현 증가가 IL-15에 의한 것인지 확인하기 위하여, 분화가 끝난 자연 살해 세포에서도 IL-15에 의해 SOCS2의 발현이 증가되는지 실험하였다. 실험에 사용된 NK-92 인간 자연 살해 세포와 초대배양 자연 살해 세포는 IL-15가 존재하는 조건에서 생존과 증식을 하게 된다. 따라서 IL-15의 효과를 측정하기 위하여 IL-15를 처리하기 전에 24시간 동안 IL-15가 없는 배지에서 배양시켜 디프리베이션(deprivation)시킨 후, 다시 IL-15를 10 ng/ml로 함유하는 배지로 교체하여 분화 조건을 만들어주었다. 배지를 교체한지 4, 8, 12 및 16 시간째의 NK-92 세포에서 상기 실시예 3-1-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하여 socs2 mRNA의 발현량을 확인하였다. 또한, IL-15 이외의 다른 사이토카인에 의해서도 SOCS2의 발현이 증가되는지 확인하기 위하여, 디프리베이션 시킨 NK-92 세포에 IL-7(Peprotech), IL-12(Peprotech), IL-15, IL-18(Peprotech) 및 IL-21(Peprotech)을 각각 30 ng/ml으로 16시간 동안 처리한 후 각 NK-92 세포에서 상기 실시예 3-1-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하여 SOCS2의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이 NK-92 세포에서 IL-15를 처리하고 4 시간까지 SOCS2의 발현이 증가한 후, SOCS2의 발현량이 유지되는 것을 관찰하였다. 또한, 도 2b에서 나타난 바와 같이 상기와 같은 SOCS2의 발현은 IL-15 자극 특이적으로 유도되는 것을 확인하였다.

<3-3> 자연 살해 세포에서 IL-15에 의한 SCOS 패밀리 발현 유도 여부 확인

본 발명자들은 IL-15에 의해 다른 SOCS 패밀리 유전자의 발현도 함께 유도되는지 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 초대배양 자연 살해 세포에 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 디프리베이션 및 IL-15 자극을 준 뒤 socs1, socs2 및 socs3의 mRNA 발현량을 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하여 측정하였다. 이때 표 1 및 표 3의 프라이머를 사용하였다.

또한, 도 2a 및 도 2b에서 확인한 IL-15에 의한 SOCS2의 발현 유도가 초대배양 자연 살해 세포에서 뿐 아니라 NK-92 세포에서도 관찰되는지 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 디프리베이션 후 16 시간 동안 IL-15 자극을 준 NK-92 세포 및 초대배양 자연 살해 세포에서 상기 실시예 3-1-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 SOCS2 단백질 발현 여부를 관찰하였다.

그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 초대배양 자연 살해 세포에서 IL-15 자극에 의해 SOCS 패밀리 중 socs2 mRNA만 발현이 증가되었다. 또한, 도 3b에서 확인한 바와 같이 NK-92 세포 및 초대배양 자연 살해 세포 모두에서 IL-15 자극에 의해 SOCS2 단백질이 발현되는 것을 확인하였다. 이로써, IL-15 사이토카인 자극에 socs2 mRNA 및 단백질의 발현이 증가되며, 이는 IL-15 및 SOCS2 상호간에 특이적으로 조절되는 것을 확인하였다.

실시예 3. IL-15에 의한 socs2 유전자의 발현 증가

<3-1> 자연 살해 세포 분화에 따른 SOCS2 유전자의 발현증가 확인

본 발명자들은 자연 살해 세포 분화단계에서 socs2 유전자의 발현양상을 분석하기 위하여 상기 실시예 1의 초대배양 자연 살해 세포 분화 조건에서 배양하였다. 구체적으로, 산모의 제대혈로부터 Human CD34 Isolation Kit를 이용하여 CD34+ 조혈모세포를 분리한 후, 분리된 CD34+ 조혈모세포를 SCF(30 ng/ml, Peprotech, 미국) 및 Flt3-ligand(50 ng/ml, Peprotech)를 첨가한 배지에서 14일 동안 배양시켜 자연 살해 세포 전구체로 분화시켰다. 상기 분화된 자연 살해 세포 전구체를 IL-15 (30 ng/ml, Peprotech)을 첨가한 배지에서 14일 동안 배양시켜 자연 살해 세포로 분화시켰다. 분화시킨지 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14일 째의 자연 살해 세포에서 socs2의 mRNA 발현을 실시간 PCR을 통해 확인하였고, 0, 4, 8 및 12일 째의 자연 살해 세포에서 SOCS2의 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 이때, 분화시킨지 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14일 째에 자연 살해 세포의 표면 마커인 CD 56의 발현도 FACS 분석을 통해 함께 확인하였다(도 1A).

<3-1-1> 실시간 PCR

구체적으로, 각 자연 살해 세포를 회수하여 Trizol Reagent(Invitrogen, 미국)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 다음, 상기 RNA 1 ㎍을 역전사효소 superscript Ⅱ(invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 2×SYBRPremix Ex TaqTM(TaKaRa, 일본), 표 2의 SOCS2 프라이머 쌍을 이용하여 실시간 PCR(real time PCR)을 수행하였다(Exicycler version 2, Bioneer, 한국). 이때, 정량적 대조군으로서 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 표 2의 GAPDH 프라이머 쌍을 사용하여 함께 실시간 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 조건으로 40 회전을 돌린 후, 72℃에서 8분 동안 신장 시켜준 뒤, 상온까지 식혀주었다. 실시간 RT-PCR 결과를 각 시료별 socs2의 발현량을 GAPDH 발현량으로 보정해주는 2^-△△Ct 비교 방법으로 분석한 후, 초대배양 자연 살해 세포에서의 socs2 발현량에 대한 각 날짜 별 분화된 자연 살해 세포에서의 상대적 발현량를 도 1a에 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 1a에서 나타난 바와 같이 배양 기간이 지남에 따라 CD56을 발현하는 자연 살해 세포가 증가하는 것으로부터 분화가 진행되고 있음을 확인하였고, 이와 비례하여 SCCS2의 mRNA의 발현도 함께 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 배양한지 8일이 지난 다음부터 socs2의 mRNA의 발현이 급속히 증가하는 것을 관찰하였다.

표 3

실시예 4. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포 분화에 미치는 영향

IL-15는 자연 살해 세포의 분화에 필수적인 사이토카인이다. SOCS2의 발현을 억제시킨 상황에서 IL-15 자극에 의한 자연 살해 세포의 분화를 측정하였다. 구체적으로, 초대배양 자연 살해 세포에 Amaxa Human CD34 Cell Nucleofector™ Kit(program U-08)를 이용하여 SOCS2 siRNA(Dharmacon, 미국, 서열번호 12: 5-CGACUACUAUGUUCAGAUG-3) 또는 대조군 siRNA(Dharmacon, 미국, 서열번호 13: 5-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3)를 도입시킨 뒤, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 디프리베이션 후 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 이후, 상기 세포에서 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 SOCS2 단백질의 발현을 확인하였다. 이때, 정량적 대조군으로서 항-β-액틴 1차 항체(Santa Cruz, 미국)를 사용하여 β-액틴의 발현을 함께 관찰하였다.

또한, SOCS2의 발현 억제가 자연 살해 세포의 분화에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 siRNA를 형질도입한 뒤 2, 3 및 5일 째의 세포에서 FACS를 수행하여 CD-56의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 초대배양 자연 살해 세포에서 SOCS2 siRNA에 의해 SOCS2 단백질의 발현이 억제되었고, 상기 SOCS2 단백질의 발현 억제는 IL-15 자극에 의해서도 회복되지 않는 것을 확인하였다. 또한, SOCS2 단백질의 발현 여부와 상관없이 IL-15 자극에 의해 CD-56의 발현이 유사하게 증가되었다. 이로부터 SOCS2는 자연 살해 세포의 분화에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포의 수용체 신호 전달에 미치는 영향

SOCS2는 SOCS 패밀리의 일원으로서, SOCS 패밀리 단백질은 사이토카인 수용체 신호전달경로에서 음성 피드백 조절자 역할을 담당한다고 알려져 있다. IL-15에 의해 인산화되는 STAT5는 JAK/STAT 신호전달경로를 활성화시켜 유전자 발현을 조절한다. IL-15에 의해 발현이 증가된 SOCS2가 IL-15 신호전달의 음성 조절자로 작용하는지 알아보기 위해, SOCS2의 발현을 억제시킨 상황에서 IL-15 자극에 따른 STAT5의 인산화를 확인하였다. 구체적으로, NK-92 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 각 shRNA 처리군마다 IL-15 함유 배지에서 배양한 경우, IL-15 비함유 배지에서 배양한 경우 및 IL-15 디프리베이션 후 10 분 동안 IL-15 함유 배지에서 배양한 경우에서 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 STAT5, 인산화된 STAT5 및 SOCS2의 단백질 발현량을 관찰하였다. 이때, 상기 실시예 3-1에서 사용한 항체 이외에 항-인산화-STAT5 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-STAT5 1차 항체(Santa Cruz, 미국)를 추가로 사용하였으며, 정량적 대조군으로 β-액틴의 발현을 함께 관찰하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 렌티바이러스를 처리한 NK-92 세포를 IL-15 비함유 배지에서 배양한 경우를 제외한 나머지 경우에서는 모두 SOCS2 발현 여부와 상관없이 STAT5가 인산화된 것을 확인하였다. 이로부터 SOCS2의 발현 억제는 STAT5 인산화에 영향을 주지 않으므로 IL-15 수용체 신호전달경로에서 음성 조절자로 작용하지 않는 것을 제시하였다.

실시예 6. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포 증식에 미치는 영향

IL-15는 자연 살해 세포의 증식에 필수적인 사이토카인이다. SOCS2의 발현을 억제시킨 상황에서 IL-15 자극에 의한 자연 살해 세포의 증식을 확인하였다. 구체적으로, NK-92 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 이후, 상기 세포에서 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Pharmingen, 미국)을 사용하여 FACS를 수행하여 아폽토시스(apoptosis)를 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 SOCS2 단백질의 발현 억제와 상관없이 모든 경우의 NK-92 세포에서 유사한 정도로 세포 증식이 일어나는 것을 확인하였다. 이로부터 SOCS2는 자연 살해 세포의 증식에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포 생존에 미치는 영향

IL-15는 자연 살해 세포의 생존에 필수적인 사이토카인이다. SOCS2의 발현을 억제시킨 상황에서 IL-15 자극에 의한 자연 살해 세포의 생존을 확인하였다. 구체적으로, NK-92 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 이후, 상기 세포에서 퍼포린(perforin), 그랜자임 B(granzyme B), NKp30, NKp40, NKp46, IL-12Rβ, IL-18R및 NKG2D의 발현을 비교하기 위해 각각 항-퍼포린 항체, 항-그랜자임 B 항체, 항-NKp30 항체, 항-NKp40 항체, 항-NKp46 항체, 항-IL-12Rβ 항체, 항-IL-18R항체 및 항-NKG2D 항체를 사용하여 FACS를 수행하였다. 이때, 정량적 비교를 위하여 각 실험군에서 IgG 발현도 함께 FACS를 통해 확인하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 SOCS2 단백질의 발현 억제와 상관없이 모든 경우에서 퍼포린, 그랜자임 B, NKp30, NKp40, NKp46, IL-12Rβ, IL-18R및 NKG2D의 발현이 유사하게 나타났다. 이로부터 SOCS2는 자연 살해 세포의 생존에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 8. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향 확인

<8-1> socs2 유전자의 발현 억제에 의한 자연 살해 세포의 암세포 살상 능력 감소

IL-15에 의해 발현이 증가되는 SOCS2가 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, SOCS2의 발현이 억제된 자연 살해 세포의 암세포 살상 능력을 측정하였다. 구체적으로, NK-92 세포 또는 분화된 자연 살해 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 디프리베이션 후 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. K562, Jurket, MCF7 또는 A549 암세포주를 100 μCi의 Na₂⁵¹CrO₄로 37℃에서 1시간 동안 표지한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 자연 살해 세포의 암세포 살상 능력을 표준⁵¹Cr-방출 분석으로 측정하였다. 상기 IL-15로 자극된 NK-92 세포를 한계 희석시킨 뒤⁵¹Cr-표지된 각 암세포 1×10⁴/100 ㎕과 함께 96-웰 플레이트(Corning, 미국)에 총 200 ㎕의 부피로 넣은 뒤 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 이후, NK-92에 의해 암세포가 용해되어 상층액으로 방출된⁵¹Cr를 감마카운터(γ-counter)로 측정하였고, 하기 수학식 1을 이용하여 특이적 암세포 사멸능을 계산하였다.

수학식 1

그 결과, 도 8a에서 나타난 바와 같이 NK-92 세포에 SOCS2 shRNA를 처리한 경우, 대조군 shRNA를 처리한 경우와 비교하여 모든 암세포에서 세포 살상능이 감소되었고, 도 8b에 나타난 바와 같이 분화된 자연 살해 세포에 SOCS2 shRNA를 처리한 경우에서도 대조군 shRNA를 처리한 경우와 비교하여 모든 암세포에서 세포 살상능이 감소된 것을 확인하였다. 이로부터 IL-15에 의한 자연 살해 세포의 활성 증가가 IL-15가 SOCS2의 발현을 유도하여 일어난 것임을 알 수 있었다.

<8-2> socs2 유전자의 발현 억제에 의한 자연 살해 세포의 NCR 자극에 의한 IFN-γ생성 감소

자연 살해 세포는 표적 세포를 인지하는 NCR을 표면에 발현하고 있는데, 표적 세포와 결합한 NCR은 자연 살해 세포 내로 신호를 전달하고, 이에 의해 자연 살해 세포는 그랜자임 및 퍼포린을 분비하여 표적 세포를 죽인다. IL-15에 의해 발현이 증가되는 SOCS2가 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, SOCS2의 발현이 억제된 자연 살해 세포의 NCR(natural cytotoxicity receptor) 자극에 의한 IFN-γ(Interferon-γ) 생성을 ELISA 분석을 통하여 측정하였다. 구체적으로, NK-92 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 디프리베이션 후 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 상기 IL-15로 자극된 NK-92 세포를 96-웰 플레이트에 3×10⁵ cells/well로 분주한 다음 아무것도 처리하지 않은 경우, NCR 자극을 준 경우[항-NKp30 단일클론항체(Santa Cruz, 미국), 항-NKp44 단일클론항체(Santa Cruz, 미국) 또는 항-NKp46 단일클론항체 처리(Santa Cruz, 미국)], 사이토카인 자극을 준 경우[IL-12(10 ng/ml) 또는 IL-18(30 ng/ml) 처리]로 나누어 16시간 동안 처리한 후, PBS로 두 번 세척하였다. 이후 상층액에 존재하는 IFN-γ의 농도를 human IFN-γ ELISA kit(Assay designs, 미국)를 이용하여 분석하였다.

또한, 상기 실시예 1-2의 분화된 자연 살해 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 상기 IL-15로 자극된 분화된 자연 살해 세포에서 아무것도 처리하지 않거나 항-NKp30 단일클론항체(Santa Cruz, 미국), IL-12 또는 IL-18을 각각 처리해 경우에서 상기 와 동일한 방법으로 IFN-γ의 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 9a에서 나타난 바와 같이 NK-92 세포에 SOCS2 shRNA를 처리한 경우, 대조군 shRNA를 처리한 경우와 비교하여 NCR 자극을 준 실험군에서의 IFN-γ 생성이 감소하였다. 그러나 사이토카인 자극을 준 실험군에서는 SOCS2의 발현 여부에 따른 IFN-γ 생성량의 차이가 나타나지 않았다. 또한, 도 9b에서 나타난 바와 같이 분화된 자연 살해 세포에 SOCS2 shRNA를 처리한 경우, 대조군 shRNA를 처리한 경우와 비교하여 NKp30을 처리한 실험군에서의 IFN-γ 생성이 감소하였다. 그러나 IL-12 또는 IL-18을 처리한 실험군에서는 SOCS2의 발현 여부에 따른 IFN-γ 생성량의 차이가 나타나지 않았다. 이로부터 자연 살해 세포의 NCR 자극에 의한 IFN-γ 생성이 SOCS2에 의해 증가되는 것을 알 수 있었다.

<8-3> socs2 유전자의 발현 억제에 의한 자연 살해 세포의 NCR 자극에 의한 IFN-γmRMA 발현 감소

상기 실시예 8-2에서 확인한 SOCS2 발현 억제에 의한 IFN-γ 생성의 감소가 IFN-γ의 mRNA 생성 단계부터 억제되는 현상인지 관찰하기 위하여 상기 실시예 8-2와 동일하게 처리한 NK-92 세포에서 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하여 IFN-γ mRNA의 발현을 확인하였다. 이때, 이때, IFN-γ 센스 프라이머(서열번호 14; 5'-gtccaacgcaaagcaataca-3') 및 IFN-γ 안티센스 프라이머(서열번호 15; 5'-ctcttcgacctcgaaacagc-3')를 IFN-γ 증폭에 사용하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 NK-92 세포에 SOCS2 shRNA를 처리한 경우, 대조군 shRNA를 처리한 경우와 비교하여 NCR 자극을 준 실험군에서의 IFN-γ mRNA 생성이 감소하였다. 그러나 사이토카인 자극을 준 실험군에서는 SOCS2의 발현 여부에 따른 IFN-γ mRNA 생성량의 차이가 나타나지 않았다. 이로부터 상기 SOCS2 발현 억제에 의한 IFN-γ 생성 감소가 IFN-γ mRNA의 발현이 억제된 것에서 비롯됨을 알 수 있었다.

실시예 9. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포 수용체 신호전달과정에 미치는 영향

자연 살해 세포가 표적 암세포와 접촉을 하게 되면 표적 암세포의 여러 가지 리간드와 자연 살해 세포 표면의 수용체가 상호작용에 의해 자연 살해 세포 내에서 다양한 신호전달과정이 진행되게 되는데, 이로 인해 자연 살해 세포가 퍼포린, 그랜자임을 분비하여 표적 암세포에 대한 세포 살상 효과가 나타나게 된다. SOCS2의 발현 억제가 자연 살해 세포의 수용체 신호전달과정에서 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, NK-92 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 상기 NK-92 세포 단독으로 또는, 표적 암세포인 K562세포와 5, 15 또는 30분 동안 함께 배양시킨 경우에서 자연 살해 세포의 인접 수용체 신호전달(proximal receptor signaling)에 관련된 Src(sarcoma, proto-oncogenic tyrosine kinases) 및 Syk(Spleen tyrosine kinase)의 인산화 및, MAPK[Mitogen-activated protein (MAP) kinases]인 JNK(c-Jun N-terminal kinases), ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 및 p38의 인산화를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다. 이때, SOCS2의 발현 및 정량적 대조군으로 β-액틴의 발현도 함께 관찰하였다. 상기 실시예 3-1에서 사용한 항체 이외에 항-인산화-Src 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-인산화-Syk 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-인산화-JNK 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-인산화-ERK 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-인산화-p38 1차 항체(Santa Cruz, 미국), Src 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-Syk 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-JNK 1차 항체(Santa Cruz, 미국), 항-ERK 1차 항체(Santa Cruz, 미국) 및 항-p38 1차 항체(Santa Cruz, 미국)를 추가로 사용하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 SOCS2의 발현이 억제된 NK-92 세포에서 Src 및 Syk의 인산화 및, MAPK 중 JNK의 인산화가 감소되었다. 그러나 ERK 및 p38은 SOCS 발현 여부에 상관없이 비슷하게 인산화되었다.

실시예 10. socs2 유전자의 발현 억제가 자연 살해 세포 MAPK 신호 전달 과정에 미치는 영향

<10-1> SOCS2가 NCR 자극에 대한 자연 살해 세포 MAPK 신호 전달 과정에 미치는 영향

SOCS2의 발현 억제가 NRC 자극에 대한 자연 살해 세포의 MAPK 신호전달과정에서 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 구체적으로, NK-92 세포에 상기 실시예 2에서 제조한 SOCS2 shRNA 렌티바이러스 또는 대조군 shRNA 렌티바이러스를 각각 10 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 16 시간 동안 IL-15 자극을 주었다. 상기 IL-15로 자극된 NK-92 세포에 아무것도 처리하지 않거나, 항-NKp30 단일클론항체를 5, 15 또는 30분 동안 처리한 다음, 항-인산화-JNK 1차 항체, 항-인산화-ERK 1차 항체, 항-인산화-p38 1차 항체, 항-JNK 1차 항체, 항-ERK 1차 항체 및 항-p38 1차 항체를 사용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 JNK, ERK 및 p-38의 인산화 정도를 관찰하였다. 이때, 항-인산화-Src 1차 항체 및 Src 1차 항체를 사용하여 Src의 인산화도 함께 관찰하였으며, 항-SOCS2 1차 항체 및 항-β-액틴 1차 항체를 사용하여 각각 SOCS2의 발현 및 정량적 대조군인 β-액틴의 발현도 함께 관찰하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 SOCS2의 발현이 억제된 NK-92 세포에서 NRC 자극 시간이 증가함에 따라 MAPK 중 JNK만 인산화가 감소되었다. Src는 SOCS2의 발현이 억제된 NK-92 세포에서 상기 실시예 9와 동일하게 NCR 자극에 대해서도 인산화가 감소되었다.

<10-2> NCR 자극에 대한 자연 살해 세포의 신호 전달 과정에서 SOCS2가 영향을 미치는 MAPK 확인

MAPK의 인산화가 자연 살해 세포의 활성과 관련이 있다는 결과들이 이미 보고가 되어 있다(Vivier et al., Science, 306:1517-1519, 2004). JNK, ERK 및 p38 중 어떤 인산화효소가 가장 중요한 역할을 담당하는지 알아보기 위해 NK-92 세포에 JNK 억제제(SP600125), ERK 억제제(PD98059) 및 p38 억제제(SB203580)를 각각 10 mM로 처리한 후 자연 살해 세포의 암세포주인 K562에 대한 살상 능력을 상기 실시예 8-1과 동일한 방법으로, NRC 자극에 대한 IFN-γ 생성을 상기 실시예 8-2와 동일한 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이 NK-92 세포에 JNK 억제제를 처리한 경우에서 암세포 살상 능력 및 IFN-γ 생성이 가장 많이 감소되었다. 이로부터 상기 실시예 10-1에서 확인한 SOCS2의 발현이 억제된 NK-92 세포의 JNK 인산화 감소가 SOCS2를 억제시켰을 때 자연 살해 세포 활성이 감소하는 주된 요인임을 알 수 있었다.

실시예 11. SOCS2 및 Pyk2 발현벡터의 제조

<11-1> SOCS2 발현벡터의 제조

SOCS2를 암호화하는 cDNA를 매멀리안 진 컬렉션(Mammalian Gene Collection, NIH, USA)에서 얻은 후, 이를 Pfu 폴리머라제(Stratagene, 미국)을 사용하여 PCR 증폭하여 pEBG(AddGene, 미국)벡터에 BamHI 및 ClaI 제한효소 부위로 삽입하였다. 이 때, SOCS2의 N-말단에 GST 표지가 첨가되도록 하였다. 구체적으로, 상기 socs2 유전자의 PCR 증폭을 위하여 서열번호 16로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GGATCCATGACCCTGCGGTGCCTTGAGCCCTCCGGGAATGGCGGGG-3')와 서열번호 17으로 기재되는 역방향 프라이머(5'-ATCGATTTATACCTGGAATTTATATTCTTCCAAGTAATCTTTTAGTC-3')를 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. SOCS2의 cDNA를 주형으로 사용하여, 94℃, 4분 처리하고 94℃, 30초, 58℃, 30초, 72 ℃, 4분 과정을 25회 반복한 후 72 ℃, 10분간 연장하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pEBG를 각각 BamHI 및 ClaI으로 절단하고 정제하였다. 벡터 및 삽입할 절편을 약 100 ng씩 사용하여, Roche 사(스위스)의 T4 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 대장균 DH5(Invitrogen, 미국)에 형질전환하여 앰피실린이 함유된 LB 아가 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 확인하였다. 상기 제조된 발현벡터를 'pGST-SOCS2'로 명명하였다.

<11-2> Pyk2 발현벡터의 제조 및

Pyk2(protein tyrosine kinase 2)를 암호화하는 cDNA(서열번호 18)를 매멀리안 진 컬렉션(Mammalian Gene Collection, NIH, USA)에서 얻은 후, 이를 Pfu 폴리머라제(Stratagene, 미국)을 사용하여 PCR 증폭하여 pBICEP-CMV-1(Sigma)벡터에 EcoRI 및 SalI 제한효소 부위로 삽입하였다. 이 때, Pyk2의 N-말단에 Flag 표지가 첨가되도록 하였다. 구체적으로, 상기 Pyk2 유전자의 PCR 증폭을 위하여 서열번호 19로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GAATTCGATGTCTGGGGTGTCCGAGCCCCTGAGTCGAGTAAAGTTGGG-3')와 서열번호 20로 기재되는 역방향 프라이머(5'-GTCGACTCACTCTGCAGGTGGGTGGGCCAGATTGGCCAGAACCTTGGC-3')를 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. Pyk2의 cDNA를 주형으로 사용하여, 94℃, 4분 처리하고 94℃, 30초, 58℃, 30초, 72 ℃, 4분 과정을 25회 반복한 후 72 ℃, 10분간 연장하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pBICEP-CMV-1을 각각 EcoRI 및 SalI으로 절단하고 정제하였다. 벡터 및 삽입할 절편을 약 100 ng씩 사용하여, Roche 사(스위스)의 T4 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 대장균 DH5(Invitrogen, 미국)에 형질전환하여 앰피실린이 함유된 LB 아가 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 확인하였다. 상기 제조된 발현벡터를 'pFlag-Pyk2'로 명명하였다.

<11-3> 돌연변이 SOCS2 발현벡터의 제조

SOCS2와 Pyk2가 결합하는 부위가 어디인지 알아보는 실험에 사용하기 위하여 SOCS2의 도메인 결실 돌연변이를 제조하였다. SOCS2를 암호화하는 cDNA를 매멀리안 진 컬렉션에서 얻은 후, 이를 Pfu 폴리머라제(Stratagene, 미국)을 사용하여 PCR 증폭하여 pEBG벡터에 BamHI 및 ClaI 제한효소 부위로 삽입하였다. 이 때, 정제 효율을 높이기 위하여 돌연변이 SOCS2의 N-말단에 GST tag을 첨가하였다. 구체적으로, SH2(Src homology 2) 도메인(서열번호 21)이 제거된 돌연변이 socs2(서열번호 22)의 PCR에는 서열번호 23로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GGATCCATGACCCTGCGGTGCCTTGAGCCCTCCGGGAATGGCGGGG-3')와 서열번호 24로 기재되는 역방향 프라이머(5'-ATCGATTTACTGACCGAGCTCCCGCAGGGCCTTCGCCAGACGCG-3'를 사용하였고, SOCS 도메인이 제거된 돌연변이 socs2(서열번호 25)의 PCR에는 서열번호 26로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GGATCCATGACCCTGCGGTGCCTTGAGCCCTCCGGGAATGGCGGGG-3')와 서열번호 27로 기재되는 역방향 프라이머(5'-ATCGATTTAAAGGTGAACAGTGCCGTTCCGGGGGGCTTCTGGACC-3')를 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. SOCS2의 cDNA를 주형으로 사용하여, 94℃, 4분 처리하고 94℃, 30초, 58℃, 30초, 72 ℃, 4분 과정을 25회 반복한 후 72 ℃, 10분간 연장하였다. 증폭된 각 PCR 산물 및 pEBG를 각각 BamHI 및 ClaI으로 절단하고 정제하였다. 벡터 및 삽입할 절편을 약 100 ng씩 사용하여, Roche 사(스위스)의 T4 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 대장균 DH5(Invitrogen, 미국)에 형질전환하여 앰피실린이 함유된 LB 아가 플레이트에서 각각 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 확인하였다. 상기 제조된 발현벡터를 각각 'pGST-SOCS2-ΔSH2' 및 'pGST-SOCS2-ΔSOCS'로 명명하였다.

<11-4> 돌연변이 Pyk2 발현벡터의 제조

Pyk2의 402 번째 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 변이된 돌연변이 Pyk2의 발현벡터를 제조하기 위하여 상기 실시예 11-2에서 제조한 pFlag-Pyk2 벡터 및 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit(Stratagene, 미국)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 돌연변이 Pyk2 발현벡터를 제조하였다. 이때, 서열번호 28의 프라이머(5'-CAGCATAGAGTCAGACATCTTCGCAGAGATTCCCGACGAAAC-3'를 사용하였으며, 'pFlag-Pyk2-Y402F'로 명명하였다.

실시예 12. SOCS2와 Pyk2의 상호작용 확인

Yeast-two hybrid screening(dualsystems Biotech, 스위스)을 통해 찾아낸 Pyk2 단백질과 SOCS2 단백질의 결합을 인간 유래 세포주에서 확인하기 위해, 상기 실시예 11-1 내지 11-4에서 수득한 발현벡터를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<12-1> 인간 세포주에서 SOCS2 및 Pyk2의 결합 확인

GST 발현 벡터 및 pFlag-Pyk2 또는, pGST-SOCS2 및 pFlag-Pyk2를 293T 세포에 Lipofectamin 2000(Invitrogen, 미국)을 이용하여 동시에 형질전환(co-transformation)시켰다. 형질도입 후 4시간 후 일반 배양 배지 또는 MG132(프로테오좀 억제제)를 포함하는 배지로 갈아준 다음 24시간 후에 세포를 용해시켰다. 용해된 각 세포를 글루타치온-세파로스 비드(GE Healthcare, 미국)와 함께 4℃에서 4시간 동안 반응시킨 다음, 항-Flag 1차 항체(Santa Cruz, 미국) 또는 항-GST 1차 항체(Santa Cruz, 미국)를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 15a에 나타난 바와 같이 pGST-SOCS2 및 pFlag-Pyk2를 함께 형질전환시킨 세포에서만 Falg가 탐지되었다. 또한, MG132를 처리한 경우, MG132를 처리하지 않은 경우와 비교하여 flag 밴드가 매우 크게 나타났다. 이로부터 효모 two-hybrid 실험결과와 동일하게 인간 세포주 내에서 SOCS2와 Pyk2가 상호결합하여 함께 침전되며, Flag로 표지된 Pyk2가 프로테오좀에 의해 분해되는 것을 알 수 있었다.

<12-2> 인간 세포주에서 SOCS2가 Pyk2의 분해에 미치는 영향 확인

상기 실시예 12-1에서 확인한 프로테오좀에 의한 Pyk2의 분해가 SOCS2에 의해 억제되는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 먼저, pGST-SOCS2, pFlag-Pyk2 및 HA-Ubiquitin(AddGene)을 293T 세포에 Lipofectamin 2000을 이용하여 동시에 형질전환(co-transformation)시켰다. 형질도입 후 4시간 후 일반 배양 배지 또는 MG132(프로테오좀 억제제)를 포함하는 배지로 갈아준 다음 24시간 후에 세포를 용해시켰다. 이후, 용해된 각 세포를 항-Flag 항체 또는 항-GST 항체와 함께 반응시킨 다음 G-단백질이 융합된 아가로즈(Roshe, 스위스)와 함께 4℃에서 하루 동안 처리하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 후, 침전된 복합체를 1×PBS로 세척한 다음 항-GST 항체, 항-Flag 항체 및 항-HA 항체(Santa Cruz, 미국)를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 15b에 나타난 바와 같이 항-Flag 항체로 침전시킨 경우에서만 GST와 HA가 탐지되었다. 또한, MG132를 처리한 경우, MG132를 처리하지 않은 경우와 비교하여 GST 밴드가 매우 크게 나타났으며, HA 밴드도 더 많이 관찰되었다. 이로부터 SOCS2는 Pyk2와 결합한 후에, Pyk2의 ubiquitinaion 현상을 일으키는 것을 알 수 있었다.

<12-3> 293 T 세포에서 Pyk2와 결합하는 SOCS2 도메인 확인

본 발명자들은 Pyk2와의 결합에 중요한 SOCS2 단백질의 도메인을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. HA-Ubiquitin, pFlag-Pyk2 및, GST 발현 벡터, pGST-SOCS2, pGST-SOCS2-ΔSH2 또는 pGST-SOCS2-ΔSOCS를 각각 293 T 세포에 Lipofectamin 2000을 이용하여 동시에 형질전환(co-transformation)시켰다. 형질도입 후 4시간 후 새배지로 갈아준 다음 24시간 후에 세포를 용해시켰다. 이후, 용해된 각 세포를 항-Flag 항체와 함께 반응시킨 다음 G-단백질이 융합된 아가로즈와 함께 4℃에서 하루 동안 처리하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 후, 침전된 복합체를 1×PBS로 세척한 다음 항-GST 항체, 항-Flag 항체 및 항-HA 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 16a에 나타난 바와 같이 pGST-SOCS2 및 pGST-SOCS2-ΔSOCS를 형질전환시킨 경우에서는 Pyk2와 결합하였지만, pGST-SOCS2-ΔSH2를 형질전환시킨 경우에서는 Pyk2와 결합하지 않았다. 이로부터 SOCS2의 SH2 도메인이 Pyk2와의 결합에 중요함을 알 수 있었다.

<12-4> 자연 살해 세포에서 SOCS2 및 Pyk2의 결합 확인

상기 293 T 세포에서 확인한 SOCS2 및 Pyk2의 결합이 자연 살해 세포에서 내재적으로 발현되는 SOCS2 및 Pyk2 사이에서도 일어나는지 확인하기 위하여 하기와 같이 내재적 면역침강 실험을 수행하였다. NK-92 세포를 용해시킨 다음 항-IgG 항체 또는 항-SOCS2 항체와 반응시킨 다음 G-단백질이 융합된 아가로즈와 함께 4℃에서 하루 동안 처리하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 후, 침전된 복합체를 1×PBS로 세척한 다음 항-Pyk2 항체, 항-SOCS2 항체 및 항-인산화-Pyk2 항체[402 번째 티로신이 인산화된 Pyk2(p-Pyk2^Tyr402)를 인지하는 항체](Santa Cruz, 미국)를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 16b에 나타난 바와 같이 자연 살해 세포 내에서도 내재적으로 발현되는 SOCS2가 Pyk2 및 p-Pyk2^Tyr402가 결합하는 것을 확인하였다.

<12-5> 자연 살해 세포에서 SOCS2 및 p-Pyk2^Tyr402의 결합 확인

상기 실시예 12-4에서 인산화된 Pyk2 및 SOCS2가 서로 결합하는 것을 확인하였다. 본 발명자들 Pyk2의 인산화가 SOCS2와의 결합에 중요한지 확인하기 위하여 하기 시험을 수행하였다. 먼저, HA-Ubiquitin, pGST-SOCS2 및, pFlag-Pyk2 또는 pFlag-Pyk2-Y402F를 각각 NK-92 세포에 Lipofectamin 2000을 이용하여 동시에 형질전환(co-transformation)시켰다. 형질도입 후 4시간 후 새배지로 갈아준 다음 24시간 후에 세포를 용해시켰다. 이후, 용해된 각 세포를 항-Flag 항체와 함께 반응시킨 다음 G-단백질이 융합된 아가로즈와 함께 4℃에서 하루 동안 처리하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 후, 침전된 복합체를 1×PBS로 세척한 다음 항-p-Pyk2^Tyr402 항체, 항-GST 항체, 항-Flag 항체 및 항-HA 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 pFlag-Pyk2를 형질전환시킨 경우에서는 SOCS2와 결합하였지만, pFlag-Pyk2-Y402F를 형질전환시킨 경우에서는 SOCS2와 결합하지 않았다. 이로부터 Pyk2의 인산화가 SOCS2와의 결합에 중요함을 알 수 있었다.

실시예 13. IL-15에 의해 증가된 SOCS2의 p-Pyk2^Tyr402 조절

자연 살해 세포 내에서 p-Pyk2^Tyr402와 결합하는 SOCS2가 어떤 양상으로 Pyk2를 조절하는지 알아보기 위한 실험을 수행하였다. IL-15를 처리하지 않거나, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 6, 12 또는 24 시간 동안 IL-15를 처리한 NK-92 세포에서 항-SOCS2 항체, 항-p-Pyk2^Tyr402 항체, 항-Pyk2 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

또한, IL-15를 처리하거나 처리하지 않은 초대배양 자연 살해 세포에서 항-SOCS2 항체, 항-p-Pyk2^Tyr402 항체, 항-Pyk2 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 18a에 나타난 바와 같이 NK-92 세포에서 IL-15의 처리시간과 비례하여 SOCS2의 발현이 증가되는데 이와 함께 Pyk2의 402번째 티로신의 인산화가 감소되는 것을 관찰하였다. 또한, 도 18b에 나타난 바와 같이 초대배양 자연 살해 세포에서도 IL-15 처리에 의해 SOCS2 발현이 유도되고 Pyk2의 인산화는 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 14. SOCS2에 의한 p-Pyk2^Tyr402의 유비퀴틴-매개 프로테오좀 분해 확인

<14-1> SOCS2에 의한 p-Pyk2^Tyr402의 유비퀴틴-매개 프로테오좀 분해 확인

상기 실시예 13에서 확인한 SOCS2 발현에 의한 p-Pyk2^Tyr402의 감소가 IL-15에 의해 증가된 SOCS2 단백질에 의해 p-Pyk2^Tyr402가 유비퀴틴-매개 프로테오좀 분해(ubiquitin-mediated proteasomal degradation)되는 것인지를 알아보기 위해 하기 실험을 수행하였다. 상기 실시예 3-2와 동일하게 IL-15를 처리한 NK-92 세포를 용해한 뒤 항-Pyk2 항체와 함께 반응시킨 다음 G-단백질이 융합된 아가로즈와 함께 4℃에서 하루 동안 처리하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 후, 침전된 복합체를 1×PBS로 세척한 다음 항-유비퀴틴 항체(Santa Cruz, 미국), 항-SOCS2 항체, 항-p-Pyk2^Tyr402 항체, 항-Pyk2 항체 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 19에서 나타난 바와 같이 NK-92 세포에서 IL-15 처리에 의해 SOCS2의 발현이 유도되면서 Pyk2의 인산화는 감소하고, Pyk2의 유비퀴틴화는 증가되었다. 이로부터 SOCS2 단백질에 의해 p-Pyk2^Tyr402가 유비퀴틴-매개 프로테오좀 분해되는 것을 알 수 있었다.

<14-2> 자연 살해 세포에서 SOCS2 발현 억제시 Pyk2 분해 억제 확인

상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 SOCS2 shRNA 또는 대조군 shRNA를 처리한 NK-92 세포 및 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 SOCS2 siRNA 또는 대조군 siRNA를 처리한 분화된 자연 살해 세포에서 항-SOCS2 항체, 항-p-Pyk2^Tyr402 항체, 항-Pyk2 항체 및 항-β-액틴 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 20에서 나타난 바와 같이 NK-92 세포 및 분화된 자연 살해세포 모두에서 SOCS2의 발현을 억제시켰을 경우, SOCS2가 발현된 경우와 비교하여 p-Pyk2^Tyr402 및 Pyk2의 발현량이 모두 증가되었다. 상기 결과는 SOCS2의 발현 억제로 인해 p-Pyk2^Tyr402 및 Pyk2가 분해되지 않았기 때문으로 사료된다.

실시예 15. SOCS2의 Pyk2 발현 억제가 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향 확인

SOCS2의 발현을 억제시켰을 때 자연 살해 세포 활성이 감소되는 현상이, SOCS2에 의한 p-Pyk2^Tyr402의 분해가 억제되어 발생한 현상인지 알아보기 위해 하기 실험을 진행하였다.

<15-1> GFP-Pyk2 발현벡터의 제조 및 Pyk2 과발현

Pyk2를 암호화하는 cDNA(서열번호 18)를 매멀리안 진 컬렉션(Mammalian Gene Collection, NIH, USA)에서 얻은 후, 이를 Pfu 폴리머라제(Stratagene, 미국)을 사용하여 PCR 증폭하여 pLVX-AcGFP-C1(Clontech, 미국) 벡터에 XhoI 및 EcoRI 제한효소 부위로 삽입하였다. 이 때, Pyk2의 N-말단에 GFP 표지가 첨가되도록 하였다. 구체적으로, 상기 Pyk2 유전자의 PCR 증폭을 위하여 서열번호 29로 기재되는 정방향 프라이머(5'-CTCGAGCCATGTCTGGGGTGTCCGAGCCCCTGAGTCGAGTAAAGTTG-3')와 서열번호 30로 기재되는 역방향 프라이머(5'-GAATTCTCACTCTGCAGGTGGGTGGGCCAGATTGGCCAGAACCTTGGC-3')를 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. Pyk2의 cDNA를 주형으로 사용하여, 94℃, 4분 처리하고 94℃, 30초, 58℃, 30초, 72 ℃, 4분 과정을 25회 반복한 후 72 ℃, 10분간 연장하였다. 증폭된 PCR 산물 및 pLVX-AcGFP-C1를 각각 XhoI 및 EcoRI으로 절단하고 정제하였다. 벡터 및 삽입할 절편을 약 100 ng씩 사용하여, Roche 사(스위스)의 T4 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 대장균 DH5(Invitrogen, 미국)에 형질전환하여 앰피실린이 함유된 LB 아가 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 확인하였다. 상기 제조된 발현벡터를 'pGFP-Pyk2'로 명명하였다.

SOCS2에 의한 p-Pyk2^Tyr402의 조절이 깨진 상황을 재현시키기 위하여 NK-92 세포에 상기 실시예 15-1에서 제조한 pGFP-Pyk2 발현벡터를 Lipofectamin을 이용하여 형질전환시킨 다음, 상기 세포에서 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 항-GFP 항체, 항-SOCS2 항체, 항-p-Pyk2^Tyr402 항체, 항-Pyk2 항체 및 항-β-액틴 항체를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 21에서 나타난 바와 같이 외인성 Pyk2 과발현 세포에서 SOCS2가 발현됨에도 불구하고 내재성 Pyk2는 거의 없어졌지만, 외인성 Pyk2 및 p-Pyk2^Tyr402는 과발현되는 것을 확인하였다.

<15-2> Pyk2 단백질의 증가가 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 상기 실시예 15-1에서 Pyk2를 과발현시킨 NK-92 세포의 암세포주인 K562 세포에 대한 살상 능력을 상기 실시예 8-1과 동일한 방법으로, NRC 자극에 대한 IFN-γ 생성을 상기 실시예 8-2와 동일한 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 22a 및 도 22b에서 나타난 바와 같이 NK-92 세포에서 Pyk2를 과발현 시켰을 때 암세포 살상 능력 및 IFN-γ 생성이 가장 많이 감소되었다. 이로부터 SOCS2를 억제시켰을 때 자연 살해 세포 활성이 감소하는 것은 SOCS2 발현의 억제가 p-Pyk2^Tyr402의 조절을 무너뜨렸기 때문임을 알 수 있었다.