METHOD FOR PREPARING RAMALIN

도 1은 출발물질 L-글루탐산과 2-하이드라지닐페놀의 합성 자리를 나타낸 간략도이다.

도 2는 본 발명에 따른 L-글루탐산에서 라말린을 합성하는 방법을 포함하는 반응의 일실시예를 나타내는 개략도이다.

도 3은 본 발명의 2-아미노페놀에서 2-하이드라지닐페놀을 합성하는 방법을 포함하는 반응의 일실시예를 나타내는 개략도이다.

도 4는 합성 라말린의¹H NMR 결과를 찍은 사진이다.

도 5는 합성 라말린의 유지기간에 따른 보존량을 각 25℃, 38℃에서 실험하여 확인한 그래프이다.

도 6은 합성 라말린과 천연물 유래 라말린의 항산화활성을 비교한 그래프이다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 2-하이드라지닐페놀(2-Hydrazinylphenol)과, 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산을 반응시킨 다음, 상기 보호를 제거하는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 1로 표시되는 라말린, 그의 염, 그의 용매화물, 또는 그의 염의 용매화물의 합성방법에 관한 것이다.

화학식 1

본 발명의 라말린은 남극 지의류인 라말리나 테레브라타로부터 분리한 항산화 활성을 갖는 화합물로, 상기 라말린은 고분해능 ES-MS를 이용해 확인한 결과, 분자량이 254.1141이고, 분자식 C₁₁H₁₆N₃O₄의 화합물로 화학식 1의 구조를 가지는 것으로 확인하였으며, 라말리나 테레브라타로부터 분리된 화합물이므로 라말린으로 명명되었다.

본 발명에서는 라말린을 라말리나 테레브라타에서 분리추출하는 대신 화학적으로 합성하는 방법을 개발하기 위해 2-하이드라지닐페놀(2-Hydrazinylphenol)과, 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산을 반응시킨 후 상기 보호를 제거함으로서 라말린이 합성되는 것을 확인하였다.

본 발명에서 상기 라말린의 염(salt)으로는 약리학적으로 허용되는 염이라면 특별히 제한되지는 않으며, 상기 약리학적으로 허용되는 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산 (아스피린)과 같은 유기산과 함께 약리학적으로 허용 가능한 산의 염을 형성하거나, 또는 소듐, 포타슘 등의 알칼리 금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약리학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다.

본 발명에서 ‘용매화물’은 용매 분자와 배위 결합하여 착물을 형성하는 고체 또는 액체 상태의 본 발명에 따른 라말린 또는 그의 염의 형태를 지칭한다. 수화물은 물과 배위 결합한 용매화물의 특정 형태로서, 본 발명과 관련하여 바람직한 용매화물은 수화물이다.

본 발명에 있어서, 상기 2-하이드라지닐페놀은 토실(Tosyl)염 형태인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 2-하이드라지닐페놀의 토실염 형태는 다음과 같은 단계로 제조할 수 있다: (a) 2-아미노페놀을 메탄올에 녹이고 염화수소 가스를 흘려주어 2-아미노페놀 염산(HCl)염을 얻는 단계; (b) 상기 2-아미노페놀 염산염을 에탄올에 녹이고, 이소펜틸 니트라이트(Isopentyl nitrite)를 사용하여 니트라미드(Nitramide) 형태의 중간체를 만드는 단계; 및 (c) 상기 중간체 에탄올 용액을, p-톨루엔설폰산(para-toluenesulfonic acid;PTSA or TsOH) 및 염화주석(SnCl₂)이 섞인 에탄올 용액에 첨가하여 2-하이드라지닐페놀의 토실염을 얻는 단계.

본 발명의 바람직한 일례로, 상기 (a) 단계에서 염화수소 가스를 흘려주면서 pH를 2 내지 5로 유지시킬 수 있으며, 그 결과, 2-아미노페놀 염산염을 고체형태로 얻을 수 있다. 또한, 상기 (b)단계에서, 에탄올에 녹인 2-아미노페놀 염산염을 낮은 온도, 약 영하 5℃에서 이소펜틸 니트라이트를 사용하여 니트라미드 형태의 중간체를 만들 수 있다. 그 후, 상기 (c)단계에서, 중간체 에탄올 용액을, p-톨루엔설폰산(para-toluenesulfonic acid;PTSA or TsOH) 및 염화주석(SnCl₂)이 섞인 에탄올 용액에 낮은 온도 (영하 5℃)를 유지하면서 천천히 첨가하여 2-하이드라지닐페놀의 토실염을 얻을 수 있다.

각 화합물은 아래와 같은 화학식으로 나타내어진다: 2-아미노페놀(2-aminophenol)(화학식 2), 2-아미노페놀 염산염(화학식 3), 2-아미노페놀 니트라미드 중간체(화학식 4), 2-하이드라지닐페놀 토실염(화학식 5).

화학식 2

화학식 3

화학식 4

화학식 5

본 발명에 있어서, 상기 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산은 일반적으로 알려진 카복실기 및 아미노기를 보호하는 방법을 이용하여 보호할 수 있다. 예를 들어, 벤질(Benzyl)기를 도입하여 카복실기 및 아미노기를 보호할 수 있다. 단, 벤질기를 사용하여 보호할 경우, 1번탄소와 2번탄소뿐만 아니라, 5번탄소의 카복실기까지 벤질기가 도입될 수 있으므로, 5번탄소의 카복실기의 벤질기를 제거하는 단계가 추가로 필요하며, 그 경우, 1번탄소의 카복실기의 보호 벤질기도 제거되는 경우가 생겨 수율 손실이 일어날 수 있다. 또한 2-하이드라지닐페놀과 반응 후에 보호를 제거하는 단계에서도 속도가 느릴 수 있다.

따라서 본 발명의 바람직한 일 양태로, 상기 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산은, 상기 카복실기와 상기 아미노기가 고리화 되어 있는 L-글루탐산 락톤인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 양태로는, 상기 L-글루탐산 락톤은 L-글루탐산을 2차 아민형태로 만든 다음, 고리화 시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 1차 아민형태에서 고리화 시키는 경우, 1번탄소뿐만 아니라 5번탄소까지 함께 7각 링이 만들어지게 되는 경우가 생기므로, 원하는 반응을 진행시키기 어려울 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, Troc을 이용하여 2차 아민형태로 만드는 반응을 탄산수소나트륨(NaHCO₃)을 사용하여 24시간동안 진행시킬 경우, 약 85% 수율로 별도 정제과정 없이 얻을 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, Troc을 이용하여 일차 산 형태로 만든 L-글루탐산은 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 첨가하고 산촉매로 PTSA(para-toluenesulfonic acid)를 사용하여 톨루엔에서 리플럭스(reflux)시키며, 반응 도중 생성되는 물을 제거하고 물이 더 이상 생성되지 않으면 탄산칼륨(K₂CO₃)을 사용하여 촉매를 제거하고 다이에틸에터(Diethyl ether)와 페트롤리움에터(petroleum ether)로 재결정하면 순수한 하얀색 고체 1차산을 얻을 수 있음을 확인하였다. 상기 1차산은 L-글루탐산 락톤이며, 하기 화학식 6과 같은 구조로 표시할 수 있다.

화학식 6

따라서 본 발명의 가장 바람직한 양태는, 상기 2차 아민형태는 L-글루탐산에 2,2,2-트라이클로로-에틸-클로로포름산(2,2,2-Trichloro-ethyl-chloroformate;Troc)을 첨가·반응시켜 제조한 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화학식 6으로 나타나는 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산(1차산)의 5번탄소의 카복실기를 활성화시켜서 2-하이드라지닐페놀과 결합반응시킬 경우, 수율 50%로 반응이 일어나는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명에 있어서, 바람직하게는 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산은 5번탄소의 카복실기가 추가로 활성화되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 카복실기의 활성화는 예를 들어, 디사이클로헥실카보다이이미드(Dicyclohexylcarbodiimide;DCC), 1-하이드록시-벤조트라이아졸(1-Hydroxybenxotriazole;HOBt), 싸이오닐 클로라이드(Thionyl chloride) 또는 에틸클로로포름산(Ethylcholoroformate)을 첨가하여 유도할 수 있다.

본 발명 일실시예에서, 상기 활성화 물질로 디사이클로헥실카보다이이미드(Dicyclohexylcarbodiimide;DCC) 및 1-하이드록시-벤조트라이아졸(1-Hydroxybenxotriazole;HOBt)을 사용하는 경우, 활성화와 동시에 결합반응이 일어나나, 반응시간이 20시간 이상이라 불안정 상태인 하이드라지닐페놀이 분해되는 문제점이 있음을 발견하였으나, 싸이오닐 클로라이드 또는 에틸클로로포름산 등을 사용할 경우 수율이 30%로 나타나므로, DCC와 HOBt(수율 50%)를 사용하여 활성화시키는 것이 보다 우수함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 가장 바람직한 양태는, 1번탄소의 카복실기 및 2번탄소의 아미노기가 보호된 L-글루탐산은 5번탄소의 카복실기를 활성화 시키기 위하여 디사이클로헥실카보다이이미드(Dicyclohexylcarbodiimide;DCC) 및 1-하이드록시-벤조트라이아졸(1-Hydroxybenxotriazole;HOBt)을 사용하고, 트라이에틸-아민(Triethyl amine;TEA)을 추가로 처리하여 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 일실시예에서, 결합된 물질에서 보호를 제거하기 위하여 동시에 아연(Zinc)과 아세트산(Acetic acid)을 사용하여 라말린을 수득하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 바람직하게는 보호를 제거하기 위하여 아연과 아세트산을 동시에 사용할 수 있다. 그 외 당해 업계에서 이미 공지된 방법으로 보호를 제거하여도 무방하다.

본 발명은 일실시예에서, 높은 항산화 활성으로 인하여, 상온에서 유지기간이 길지 않은 라말린을 비타민 C가 함유된 용매에 용해시켜 유지시킬 경우, 확연히 오래 유지되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 다른 관점에서, 라말린을 비타민 C(L-Ascorbic acid)를 함유하는 용매에 용해시켜 유지하는 것을 특징으로 하는 라말린의 분해 방지방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 라말린을 용해시키는 농도는 비타민 C의 농도와 같은 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 라말린을 용해시키는 용매를 물로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 물에 비타민 C와 라말린을 1000ppm 농도로 용해시켜 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 1번탄소의 카복실기와 2번탄소의 카보닐기가 보호된 글루탐산의 제조 및 2-하이드라지닐페놀의 준비

1-1: Troc-L-글루탐산의 제조

도 1에 나타난 개략도에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라말린의 합성에 필요한 Troc-L-글루탐산을 제조하기 위하여, 아래와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 500ml two neck round flask에 31.5g (0.375mol)의 NaHCO₃를 물 125ml에 녹여 수용액(solution)을 만들었다. Reflux condenser와 dropping funnel을 설치하고 14.7g (0.1mol)의 L-글루탐산(L-Glutamic acid)을 상온에서 magnetic bar를 이용하여 교반하면서 천천히 첨가하였다. 반응물의 온도를 35℃로 올리고 2,2,2-Trichloroethylchloroflomate를 천천히 dropping 시켜주었다. 반응 mixture를 40~45℃의 온도로 가열하고 6시간 교반하였다.

이후 온도를 다시 상온으로 낮춰준 후 약 15시간 정도 계속 교반하였다. 반응이 완료되면 Diethylether(30ml)를 첨가하여 물층을 씻어주고 유기층을 제거하였다. 물층에 5M HCl을 서서히 첨가하여 pH를 2 이하로 낮춰준 후 Ethylacetate(이하, EA)를 3회(50ml x 3)에 걸쳐 extraction하면서 물층에 남아있는 product를 녹여내었다. EA 추출물을 MgSO₄로 물을 제거하고 rotary evaporator로 건조시켰다. EA가 모두 제거되고 난 후, 옅은 노란색 액체의 product를 얻어내었다.

그 결과, 도 2의 첫번째 반응 후 나타낸 화합물과 같이, N-Troc 으로 보호된 Troc-L-글루탐산의 수율은 약 85%정도 이었으며 별도의 정제 과정 없이 높은 순도로 얻을 수 있었다.

또한, 생성물의 구조를 확인하기 위하여, NMR 스펙트럼 (1D 및 2D)은 D₂O 에 더하여, 아세톤-d₆를 사용하여, JEOL JNM ECP-400 spectrometer (¹³C¹H 및 500 MHz에 대한 500 MHz)를 이용하여 기록하였다. 이 때, 케미컬 쉬프트는 잔여 아세톤-d₆ (dH/dC = 2.22/21.0)을 참조하였다. HMQC 및 HMBC 실험은¹JCH = 140 Hz,ⁿJCH = 8 Hz 조건에서 최적화 되었다.

그 결과,¹H NMR (δppm, acetone d6) : 1.55-2.75 (m, 4H, CH₂CH₂); 4.15-4.55 (m, 1H, CH); 4.70 (s, 2H, CH₂CCl₃); 6.65 (d, J 8Hz, 1H, NH); 10.6 (s, 2H, OH)와 같은 결과를 나타냄을 확인하였다.

1-2: 고리화 반응

실시예 1-1에 의해 얻어진 Troc-L-글루탐산의 보호된 카복실기와 아미노기를 서로 고리형태로 엮어 보호하기 위해 아래와 같은 방법으로 고리화 반응을 시켰다. 이를 위하여, 500ml round flask에 N-Troc glutamic acid (0.04mol)를 넣고 toluene 200ml를 첨가하여 녹였다. Flask에 Deak-stark 장치를 연결하고 위에 reflux condenser를 설치한 후, 위 flask에 0.08mol의 paraformaldehyde (2.4g), 0.0024mol의 PTSA (0.46g)를 첨가하였다. 반응온도를 120℃로 높이고 교반하면서 reflux시키고, Dean-stark에 더 이상 물이 생기지 않을 때까지 (약 3시간) 가열하였다.

반응이 완결된 후, 상온으로 식히고 EA 50ml를 첨가하였다. 그 후, 유기층을 층분리하고 0.3M K₂CO₃ 4ml를 첨가하여 층분리 시켰다. 물을 3회에 걸쳐 5ml씩 첨가하여 씻어내었다. 유기층을 MgSO₄로 수분을 제거하고 solvent를 evaporation으로 제거하였다. 건조 후 생긴 하얀색 고체를 Ether 5ml, petroleum ether 5ml 첨가하여 씻어주었다.

그 결과, 도 2의 두번째 반응 후 나타낸 화합물과 같이, Filter후 건조하여 순수한 흰색 고체를 수율 85%로 얻어내었다. 이 흰색고체는 N-트라이클로로에틸옥시카보닐-L-글루탐산 락톤(N-Trichloroethyloxy carbonyl-L-glutamic acid lactone)으로, 고리화 반응이 일어나 1번탄소의 카보닐기와 2번탄소의 아미노기가 고리화 되어 보호된 화합물로 확인하였다.

또한, 생성물의 구조를 확인하기 위하여, NMR 스펙트럼 (1D 및 2D)은 D₂O 에 더하여, 아세톤-d₆를 사용하여, JEOL JNM ECP-400 spectrometer (¹³C¹H 및 500 MHz에 대한 500 MHz)를 이용하여 기록하였다. 이 때, 케미컬 쉬프트는 잔여 아세톤-d₆ (dH/dC = 2.22/21.0)을 참조하였다. HMQC 및 HMBC 실험은¹JCH = 140 Hz,ⁿJCH = 8 Hz 조건에서 최적화 되었다.

그 결과,¹H NMR (δppm, acetone d6) : 2.15-2.65 (m, 4H, CH₂CH₂) ; 4.51 (m, 1H, CH) ; 4.82-5.00 (m, 2H, CH₂CCl₃) ; 5.37-5.59 (m, 2H, NCH₂O) ; 10.32 (s, 1H, OH)와 같은 결과를 나타냄을 확인하였다.

1-3: 2-하이드라지닐페놀의 준비

2-하이드라지닐 페놀을 만들기 위하여, 2-아미노페놀을 준비하여, Round flask에 2-Aminophenol 50g (0.46mol)을 넣고 상온에서 메탄올에 완전히 녹였다. 별도의 HCl gas 투입관을 통하여 bubbling시키면서 pH를 2~5정도로 유지시키며 15시간 이상 교반을 진행하였다. (pH는 2~5 계속 유지) 질소가스로 약 30분간 purge한 후 Rotary evaporator로 농축하였더니 갈색 고체가 생성되었다. 이 고체를 EA:Hexane = 3:7 용액으로 씻어준 후 filter 하여 완전 건조시켰다. 생성된 고체(2-아미노페놀 하이드로젠 클로라이드)를 수득하였다.

그 후 상기 수득된 고체 60g (0.41mol)을 에탄올 300ml에 완전 녹인 후 온도를 -5℃로 낮추었다. Isopentyl nitrite 55.3g (0.41mol)을 에탄올에 희석하여 starting solution에 천천히 dropping 시켜준 후 30분간 교반하였다(온도는 -5℃ 계속 유지). 다른 round flask에 Tin chloride 156.3g (0.82mol)과 PTSA 78.4g (0.41mol)을 EtOH에 녹인 후 온도를 -5℃로 낮춰놓고 반응중이던 Aminophenol mixture를 서서히 첨가하면서 교반을 1시간 이상 진행하였다. 반응이 완결되면 diethylether 500ml를 투입하여 10분간 교반 진행한 후 석출된 고체를 filter하였다. Filter된 고체를 EA 200ml, Hexane 400ml로 세척한 후 건조하여 2-Hydroxy phenyl hydrazine toluene sulfonic aicd salt를 얻었다. 본 반응의 개략도를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3의 개략도 끝에 나타낸 화합물과 같이, 2-하이드라지닐 페놀을 제조하였으며, 위 반응의 수율은 약 80% 수율임을 확인하였다.

또한, 생성물의 구조를 확인하기 위하여, NMR 스펙트럼 (1D 및 2D)은 D₂O 에 더하여, 아세톤-d₆를 사용하여, JEOL JNM ECP-400 spectrometer (¹³C¹H 및 500 MHz에 대한 500 MHz)를 이용하여 기록하였다. 이 때, 케미컬 쉬프트는 잔여 아세톤-d₆ (dH/dC = 2.22/21.0)을 참조하였다. HMQC 및 HMBC 실험은¹JCH = 140 Hz,ⁿJCH = 8 Hz 조건에서 최적화 되었다.

그 결과,¹H NMR (δppm, CD3OD) : 2.37 (s, 3H); 6.85 (m, 2H); 7.00 (m, 2H); 7.24 (d, J=10, 2H); 7.71 (d, J=10, 2H)와 같은 결과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 2: 라말린의 합성

2-1: 2-하이드라지닐 페놀과 L-글루탐산 락톤의 결합반응

2-1-1: DCC 및 HOBt로 활성화된 L-글루탐산 락톤과의 결합반응

실시예 1-2의 결과물인 N-트라이클로로에틸옥시카보닐-L-글루탐산 락톤 5g (14.9mmol)을 80ml의 MC(methylene chloride)에 녹인 후 (5ml/mmol) 1.35eq DCC 4.16g, 1.5eq HOBt 3.03g을 첨가하고 magnetic bar를 이용하여 교반하였다. 다른 flask에 1.2eq의 2-Hydrazinylphenol tosyl salt(2-Hydroxyl phenyl hydrazine tosyl salt) 4.9g과 TEA 2.5ml를 MC에 넣어주고 온도를 0℃로 낮추었다. 만들어진 Hydrazine solution을 위의 Starting solution에 0℃에서 천천히 dropping 시켰다. 0℃에서 1시간 반응 후 상온으로 온도를 올려 12시간 이상 반응시켰다. TLC 를 통해 반응 완결여부를 확인하고 반응이 완결되면 반응물을 1N HCl, saturated NaHCO₃, brine으로 각각 3회씩 씻어내 주었다. 유기층을 분리하고 MgSO₄로 물을 제거하였다.

그 결과, Solvent가 제거된 crude product를 얻었다. 이는 정제과정 없이 다음 반응에 사용될 수 있다. 정제결과, 반응 수율은 약 50%정도로 확인되었다.

2-1-2: 싸이오닐 클로라이드로 활성화된 L-글루탐산 락톤과의 결합반응

50ml 플라스크에 실시예 1-2의 결과물인 N-트라이클로로에틸옥시카보닐-L-글루탐산 락톤 0.01mol을 순수한 CCl₄ 2ml에 녹인 후 교반하면서 0.05mol의 thionyl chloride (3.7ml)를 첨가하였다. Reflux condenser 를 설치하고 수조를 이용하여 온도를 70℃로 가열하였다. 가열이 진행되면 가스가 발생하는데 gas meter기 또는 풍선을 이용하여 가스 발생여부를 확인하였다. 더 이상 gas가 발생하지 않았을 때, 온도를 상온으로 낮추고 용매를 모두 제거하였다. 순수한 무수상태의 CH₂Cl₂를 첨가하여 다시 evaporation 시켜 잔존물인 HCl이나 sulfur dioxide를 제거하였다.

그 다음, 완전 건조된 100ml round flask에 활성화된 L-글루탐산 락톤(약 0.01mol)을 첨가하고 50ml CH₂Cl₂로 녹였다. 다른 flask에 2-Hydrazinylphenol tosyl salt (0.0095mol)과 Triethylamine (0.0095mol)을 MC에 넣어주어 완전히 녹였다. 만들어진 Hydrazine solution을 위의 starting solution에 천천히 넣어주고 pyridine (0.8mL)을 첨가하였다. 반응물을 40℃로 약 3시간 가열하고 온도를 상온으로 낮춰 약 15시간 교반을 진행하였다. 이후 증류수 15ml와 NaHCO₃ 포화용액 15ml로 씻어주고 다시 증류수 15ml로 2회 씻어내었다. 유기층을 MgSO₄로 처리하여 물을 제거하고 여과한 후 농축하여 crude product를 얻어내었다.

그 결과, crude product의 수율은 약 30%정도로 확인되었다.

2-2: 보호를 제거하여 라말린을 수득하는 반응

실시예 2-1의 생산물, 즉 Coupling 되어진 N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamic acid lactone phenyl hydrazine 에서 보호기를 제거하여 순수한 라말린을 얻기 위하여, 790mg의(0.0018) 생산물을 100ml round flaks에 넣고 acetic acid 6ml에 녹였다. Magnetic bar로 교반하면서 물 7ml를 서서히 첨가하고 Zinc powder 1g을 첨가하였다. Zinc powder를 첨가한 시점부터 약 2분정도 반응물의 색이 투명해짐을 관측하였다. 이때 물 5ml를 천천히 첨가한 후 5분간 더 교반하였다. 5분 후 filter하여 zinc를 제거하고 MC 10ml로 2회 씻어주었다. 물층을 농축하고 reverse phase column chromatography로 정제하여 라말린(Ramalin)을 얻는다. 이상 1-1 내지 2-2에 대한 반응 방법의 개략도를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

이 반응에 의하여 라말린을 얻을 수 있었으며, 정제 후 수율 약 40%임을 확인하였으며, 순도는 99%정도로 확인되었다. 합성한 라말린은 고체상태에서 저온 (-24℃) 보관하였다.

생성물의 구조를 확인하기 위하여, NMR 스펙트럼 (1D 및 2D)은 D₂O 에 더하여, 아세톤-d₆를 사용하여, JEOL JNM ECP-400 spectrometer (¹³C¹H 및 500 MHz에 대한 500 MHz)를 이용하여 기록하였다. 이 때, 케미컬 쉬프트는 잔여 아세톤-d₆ (dH/dC = 2.22/21.0)을 참조하였다. HMQC 및 HMBC 실험은¹JCH = 140 Hz,ⁿJCH = 8 Hz 조건에서 최적화 되었다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 합성된 라말린의 NMR 결과를¹H NMR (δppm, CD₃OD d6) : 2.18 (m, 2H); 2.50 (m, 2H); 3.77 (t, J=6, 1H); 6.85 (m, 4H) 와 같이 얻었으며, 그 구조가 천연물에서 분리된 라말린과 같음을 확인하였다.

실시예 3: HPLC를 통한 라말린 안정성 증진 확인

라말린은 자체의 높은 항산화력으로 인하여 쉽게 분해되며, 상온에서 4일이내에 절반이상 사라질 정도로 불안정하므로, 본 실시예에서는 라말린을 오래 유지하기 위한 방법을 얻기 위하여, 비타민 C(L-Ascobic acid)를 1:1 (각 1000 ppm) 첨가하여 각 25℃, 38℃의 물에서 보관하여 안정성을 확인하였다.

시간 별로 10㎕ sample을 Agilent Eclipse XDB-C18 칼럼(4.6 x 150mm)을 사용하여 준 분취 역상 HPLC(semi-preparative reverse phase HPLC)로 분석하였다. 사용한 용매 시스템은 0.1% 포름산이 섞인 물(A Line)과 0.1% 포름산이 섞인 메탄올(B line)을 사용하였다. 시작은 메탄올 0%에서 5%까지 15분, 5% 에서 90% 까지 5분, 90%에서 다시 0%까지 5분, 마지막 0%에서 5분 유지하여 총 30분 분석을 진행한다. 유속은 0.7ml/분으로 하였다. 그 후, HPLC의 area값(mAU x S)으로 라말린의 양의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 아무것도 첨가하지 않은 경우, 시간에 따라 라말린이 빠른 속도로 분해됨을 확인할 수 있었다. 반면 라말린과 비타민 C(L-Ascobic acid)를 1:1 (각 1000 ppm) 첨가하여 물에서 보관한 경우, 라말린의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 한편, 4일 이전에 모든 라말린이 사라지는, 가혹조건인 38℃에서도 어느 정도의 안정성을 확인할 수 있었다. 38℃ 조건의 경우, 비타민 C가 먼저 깨져 나가고 이후 라말린이 사라지기 시작하는데, 약 200시간 이후, 즉 비타민 C가 거의 사라진 후에도 어느 정도 안정성을 유지시켜주는 효과를 보임을 확인하였다.

실시예 4: 천연물 유래 라말린과 합성 라말린의 항산화 활성 비교

천연물에서 추출한 천연물 유래 라말린과, 합성 라말린의 항산화 활성을 비교하기 위하여, 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl(DPPH) 자유 라디컬에 대한 활성을 측정하였다. Butylated hydroxyl anisole(BHA)을 대조군으로 사용하였다. 또한 실험에 사용한 화합물의 순도는 모두 98% 이상의 상태에서 측정하였다.

구체적으로, 1.5ml 여러 농도 (0.1~ 3.0ug/ml)의 메탄올에 녹인 천연물 유래 라말린, 합성 라말린과 대조군인 BHA를 동일 용매에 녹인 0.1mM DPPH 0.5ml를 혼합하였다. 빛을 차단 시킨 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 흡광도 측정은 UV-visible spectrophotometer(SCINCO, 대한민국)를 이용하여 517nm에서 측정하였다. Blank는 1.5ml 메탄올에 0.1mM DPPH 0.5ml와 반응 시킨 것이다. 전자공여능력은 다음 식으로 계산하였다.

electron donating abilities(DEA) % = {1-(S/B)} × 100

S는 DPPH와 시료를 반응 시킨 후 흡광도 517nm에서 측정한 값, B는 DPPH와 메탄올을 반응 시킨 후 흡광도 517nm에서 측정한 값이다.

그 결과, 도 6 및 표 1에 나타난 바와 같이, 천연물 유래 라말린의 IC₅₀ 값이 1.22 μg/ml였고 합성한 라말린의 경우 0.96 μg/ml로 천연물에서 추출한 라말린과 합성한 라말린이 거의 동등한 뛰어난 항산화력을 보임을 확인하였다.

표 1

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.