Способ количественного определения нитратов в пищевых продуктах
Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано
для определения в пищевых продуктах токсичных нитратов, потенциальная опасность которых для здоровья
человека связана с возможностью их эндогенного восстановления до нит-
ритов, вызывающих метгемоглобинемию, обладающих иммунодепрессивным и тератогенным
действием и являющихся предшественниками образования канцерогенных нитрозов соединений. Цель изобретения - повышение точности и воспроизводимости. Для этого экстракт очищают на активированном угле, элюат разбавляют
в 2,5-5 раз водой, полученной дистилляцией из щелочной среды, после нитрования
в реакционную смесь вводят 2-нитротолуол (2-НТ) - внутренний
стандарт при количественной оценке концентрации нитрата. Обе эти процедуры направлены на повышение точности предлагаемого способа
по сравнению с известным спосо- бом. Очистка активированным углем
позволяет отделить компоненты матрик- са пищевого продукта, вступающие в
побочные реакции нитрования с анализируемым ионом нитрата, в первую очередь
белки, содержащие легко нитрози- руемые ароматические аминокислоты.
Отсутствие этой стадии в методе известного способа является одним из
основных Аакторов, снижающих действительное содержание нитрата. Разбавление водой позволяет проводить нитрование бензола на фоне в 10 пять раз меньших „количеств веществ
из продукта, не задержанных активиро ванным углем, так как аликвота экстракта
при нитровании по предлагаемому, методу соответствует 0,02 г образца вместо 0,1 г - в известном способе.
При этом относительная концентрация основного мешающего однозначному нитрованию
бензола аниона хлорида (побочное образование хлористого иитро- зила) снижается в 2,5 раза по сравнению
с известным способом, т.е. имеется в виду не уменьшение относительной концентрации NOj и С1, которые не
меняются при разбавлении, а снижение абсолютной концентрации хлорида. Существенным приемом является введение в реакционную смесь после нитрования
и перед количественным опре- JQ делением методом газожидкостной хроматографии
(ГКХ) внутреннего стандарта , в качестве которого впервые использован 2-нитротолуол. 2-Нитротолуол наиболее близок к 25 определяемому веществу нитробензолу по хроматографической подвижности
(относительное удерживание на хрома- тографической колонке составляет Т определения калибровочного коэффицг ента НБ по внутреннему стандарту 2-
НТ. Для установления точных концентраций эталонных растворов измеряют и
оптическую плотность при длинах волн 330 и 257 нм соответственно. Готовят
рабочий калибровочный раствор с концентрацией НБ и 2-НТ по 2 нг/мкл.
Для определения калибровочного коэффициента (К) НБ по 2-НТ в газовый
хроматограф вводят 1-2 мкл калибро-я вочного раствора. Условия хроматогра
фического анализа на газовом хроматографе с детектором электронного эах-
, вата следующие: стеклянная колонка 2 мх 0,3 см} жидкая фаза - 3%/ температура
колонки 110°С, температура испарителя 200 Су температура детектора
230 С1, скорость газа-носителя (азота подбирают, исходя из времени выхода
растворителя (бензола) порядка 20 с; скорость газа продувки детектора 50-
100 мл/мин. В описанных условиях время выхода НБ составляет 2,5 - 3,5 мин
а время выхода 2-НТ - 3,7 - 5 мин. Критерием идентификации пика НБ является
совпадение его относительного отн приведенного времени удерживания по
Jj| 1,44)-, нитробензол и 2-нит- стандарту 2-НТ,определяе мому по формуле ротолуол близки по структуре и дают аналогичный по величине сигнал в детекторе
электронного захвата при ГЖХ Способ осуществляют следующим образом . Выделяют нитраты из пищевых продуктов путем встряхивания измельченной навески пробы в дистиллированной
воде о Осуществляют очистку экстракта пропусканием его через колонку, содержащую
смесь уголь - целит, и нитрование бензола нитратами разбавлен35 40 HKJL r r T&H7 где Т отн - относительное приведенное время удерживания НБ, Т Mg- - время выхода НБ;
Т Иг время выхода 2-НТ; , - время выхода растворителя я НБ на жидкой фазе ОУ-1 VM при температуре колонки 110 С составляет величину порядка 0,62-0,68 и определяется
экспериментально. Калибровочный коэффициент К определяют по ной в 2,5-5 раз аликвоты элюата в присутствии серной кислоты. К реакци онной смеси добавляют внутренний
стандарт 2-НТ и проводят количественное определение с помощью ГЖХ с детектором электронного захвата. В качестве основного стандартного раствора нитрата используют эталонны
раствор нитрата калия с концентрацие «10 моль/л. Для проведения ГЛХ используют
эталонные растворы в гекса- не нитробензола (НБ) с концентрацией 0,5 мкг/мкл и 2-НТ с концентрациями
0,5 мкг/мкл (I) и 0,05 мкг/мкл (II), а также калибровочный раствор смеси
НВ и 2-НТ, который предназначен для Q 5 определения калибровочного коэффицг ента НБ по внутреннему стандарту 2-
НТ. Для установления точных концентраций эталонных растворов измеряют их
оптическую плотность при длинах волн 330 и 257 нм соответственно. Готовят
рабочий калибровочный раствор с концентрацией НБ и 2-НТ по 2 нг/мкл.
Для определения калибровочного коэффициента (К) НБ по 2-НТ в газовый
хроматограф вводят 1-2 мкл калибро-я вочного раствора. Условия хроматогра-
фического анализа на газовом хроматографе с детектором электронного эах-
, вата следующие: стеклянная колонка 2 мх 0,3 см} жидкая фаза - 3%/ температура
колонки 110°С, температура испарителя 200 Су температура детектора
230 С1, скорость газа-носителя (азота) подбирают, исходя из времени выхода
растворителя (бензола) порядка 20 с; скорость газа продувки детектора 50-
100 мл/мин. В описанных условиях время выхода НБ составляет 2,5 - 3,5 мин,
а время выхода 2-НТ - 3,7 - 5 мин. Критерием идентификации пика НБ является
совпадение его относительного готн HKJL
r r T&H7 где Т отн - относительное приведенное время удерживания НБ, Т Mg- - время выхода НБ; Т Иг время выхода 2-НТ;
, - время выхода растворителя, я НБ на жидкой фазе ОУ-1 VM
при температуре колонки 110 С составформуле ляет величину порядка 0,62-0,68 и определяется экспериментально. Калибровочный
коэффициент К определяют по К , 2ИГ ь
%{f где h формуле ит иЕГ высота пика внутреннего
стандарта 2-НТ, мм высота пика НБ, мм. Проверку калибровочного коэффициента
проводят перед началом работы и после каждых пяти анализов образца. Перед ПЧХ определением в анализируемую пробу первоначально добавляют
10 мкл эталонного раствора НТ, что соответствует 0,5 мкг 2-НТ. Если при
этом высота пика НБ в 3 и более раз превышает высоту пика внутреннего
стандарта, то по хроматограмме приблизительно оценивают концентрацию нитрата в пробе и затем повторяют
анализ с другой аликвотой (О,1 мл) экстракта пробы. При этом увеличивают количество внутреннего стандарта
в соответствии с табл. 1. Результаты определения нитратов представлены в табл. 1. На хроматограмме измеряют высоты пиков НБ и 2-НТ. Расчет концентрации
нитрата проводят по формуле 50 (0,5 К JlJeS -.
Нг m HT- m + где С - концентрация нитрата в пробе, мг/кг,
п Нг масса внутреннего стандарта, -добавленного в пробу8 мкг;
масса нитрата, вносимого с применяемыми реактивами, мкГ.
Массу нитрата, вносимого с используемыми реактивами (пО , определяют
согласно основной схеме, только вместо экстракта анализируют бидистилли-
рован.ную воду. Расчет проводят по формуле 0,5 К га нг нт 25 промывают 10 мл бидистшшированной. воды. Из 50 мл объединенного элюата
отбирают 0,2 мл, добавляют 0,3 мл би- дистиллированной воды, 3 мл перегнанного
бензола, 3 мл концентрированной серной кислоты и осторожно встряхивают 10 мин, поддерживая с помощью
песчаной бани температуру Ю 50-609С, по необходимости открывая
пробку для выравнивания давления. После охлаждения в реакционную смесь
добавляют 10 мкл эталонного раствора (1) что соответствует 5 мкг 15 2-ПТ. После встряхивания и разделения слоев декантируют 1,5 мл верхнего бензольного
слоя в пробирку, содержащую 1 мл дистиллированной воды (для удаления остатков следов серной кислоты
20 из бензольного слоя) .В газовый хроматограф вводят 0,2; 0,5 и 1 мкл верхне-
го бензольного раствора. Расчет количества нитратов, вносимых с реактивами: 0,5 К . m Кг мт 0,5М,4 12 60 хО,5 0,11 мкг. Расчет концентрации нитратов в пробе:
при вколе 0,2 мкл Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к методам анализа токсичных нитратов в пищевых продуктах. Цель изобретения - повышение
точности и воспроизводимости способа . Для этого экстракт очищают от примесных соединений на активированном
угле, элюат разбавляют водой, после нитрования в реакционную смесь вводят 2-нитротолуол - внутренний стандарт при количественной оценке концентрации нитрата с помощью метода
газожидкостной хроматографии. 6 табл. Определение Гофпроводят для каждой новой партии серной кислоты, бидистил
лированной воды и бензола. Предел обнаружения метода составляет
0,2 мг/кг при относительном стандартном отклонении 0,02-0,10, степень
извлечения добавленного к образцу нитрата 67-90%. Пример 1. К 5 г измельченной
на терке пробы картофеля (предельно допустимая концентрация (ПДК) нитратов
в картофеле 80 мг/кг) добавляют 25 мл Оидистиллированной воды и перемешивают
в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Декантированный раствор пропускают через колонку
(1,2x15 см), содержа1тую 1 см3 смеси уголь - целит (2:1) - нижний слой и
0,5 см3 целита - верхний слой, предварительно промытую 10 мл бидистилли-
рованной воды. Для увеличения скорости тока жидкости можно использовать вакуум водоструйного насоса
(15 мм рт.ст.). Остаток пробы промы- , вают бидистиллированной водой (3x5 мл)
и промывные воды также пропускают через колонку, которую окончательно 50 (0Э5 К h u,m иг - m 35 1 1 50 (о,5к1, - 0, 11) 86,2 мкг; при вколе 0,5 мкл С 50 (0,5Н,4х-||- 5 0 ,11) 90,5 мкг при вколе 1 мкл 50 50 (0,.5x1,4 х-™ 5 5 0 0,11) j
- 86,6 мкг. Относительное стандартное отклонение
при последовательных вводах в хроматограф составило 0,03. Пример 1а. Определение содержания нитратов в капусте по предложенному способу. .Пять навесок-по 10 г капусты, измельченной в мясорубке, помещают в
5 конических колб на 250 мл, добавляют по 50 мл бидистиллированной (над
щелочью) воды и перемешивают на аппарате для встряхивания. Декантированные
растворы пропускают через 5 коло- нок (1,2x15 см), содержащих 2 см1 смеси уголь - целит (2:1) - нижние слои и 0,5 см3 целита - верхние
слои, предварительно промытые 10 мл бидистиллированной воды (над щелочью), с использованием вакуума
водоструйного насоса. Остатки проб промывают бидистиллированной водой мл) и промывные воды также
пропускают через колонки, которые окончательно промывают 20 мл бидистиллированной
воды. Из 100 мл объединенных элюатов отбирают по 0,2 мл и далее нитрование и анализ проводят
согласно примеру 1. Для получения до- стоверных количественных результатов
в газовый хроматограф вводят произвольный объем бензольных растворов
(около 0,1 мкл), контролируя лишь отклонение пера самописца, которое не
должно превышать полной его шкалы. Полученные результаты представлены
в табл. 2. Количество нитрата, вносимого с реактивами тф 0,15 мкг. Пример 2. Определение фонового содержания нитратов по предложенному
методу при использовании обычной дистиллированной воды. Определяют фоновое содержание нит- ратов при использовании двух партий
дистиллированной воды, осуществляя нитрование бензола согласно примеру 1,
однако вместо 0,2 мл экстракта и 0,3 мл бидистиллированной воды в ре-
акционную смесь добавляют 0,5 мл дистиллированной воды: т-для воды 0,5х1,4 ---ХО,5 0,74 m 27 для водыг 0,5x1,4 -rr-xO,5 - 0,47 мкг.
Таким образом, фоновое количество нитратов, вводимых с водой и кислотой
при использовании бидистиллированной воды (над щелочью) значительно ниже (0,11 мкг, пример 1).
Определение оптимального объема пробы (0,2 мл). Пример За. Определяют содержание нитратов в пробе капусты (измельченной на мясорубке) согласно
примеру 1. Получают: « 0,5x1,,5 0,14 мкг, Cf 50 (0,,6 -™-Х40 - 0,14) 289,3 мг/кг. В другую навеску измельченной
капусты (5 г) вносят добавку нитрата в количестве 300 иг/кг (ПДК нитратов
в капусте 300 мг/кг), что соответствует 15 мкл рабочего стандартного раствора
нитрата или 1,5 мг нитрата в пересчете на N0. Экстракцию и очистку экстракта проводят согласно примеру
1. Получают: тф 0,14 мкг$ 32 СЈ 50 (0,5х1, - 0,14) 495,0 мг/кг. Степень извлечения N0$ составила .Х100% - -125,0-2§9, 300
68,6%, Пример 36. Определяют содержание нитратов в пробах капусты без
добавки и с добавкой нитратов согласно примеру 1, однако из 50 мл объединенного
экстракта для анализа отбирают 0,3 мл. Расчет проводят по следующей формуле: С, 33,3 (0,5 К 51 1 иг m HT m f 33,3 (0,5И, - 0,14) 211,0 мг/кг (концентрация нитратов
в пробе без добавки нитратов); 0,5к1,6л-™-хО,5 0,14 мкг; С2 - 33,3 (0,,6д-||-к40-0,14) 368,3 мг/кг. Степень извлечения N0
-. -тш.,,00 . . Пример JB, Определение содержания
нитратов в пробах капусты без добавки и с добавкой нитратов согласно примеру 1, однако из 50 мл
объединенного экстракта отбирают 0,5 мл. Расчет проводят по формуле m . - m) С - 20 (0,5 К --& «г
Получают: мг Г 20 m « 0,5M,6 -Јg-nO,5 0,17 мкг,С , - 20 (0,5к1,6к ||-«40-0,17)
174,1 мг/кг (концентрация нитратов в пробе без добавки нитратов)}
С4 20 (0,,6х--™-х40-0, 17) 297,1 мг/кг (концентрация нитратов
в пробе с добавкой нитратов). Степень извлечения NOT . .297,1-17Д, 41%
Нз примеров За, б, в следует, что разбавление пробы при нитровании в
2,5 раза снижает потери нитратов в анализе. Пример 4. Определение содержания
в пищевых продуктах по известному способу. К 10 г измельченной пробы картофеля
добавляют 100 мл дистиллированной воды и перемешивают в течение 30 мин
на аппарате для встряхивания. Раствор Лильтруют через вату. Отбирают 1 мл
фильтрата, добавляют 3 мл бензола, 3 мл концентрированной серной кислоты и осторожно встряхивают 10 мин,
периодически открывая пробирку для выравнивания давления. После расслоения
органический слой декантируют и в испаритель хроматографа последовательно трижды вводят 1 мю бензольного
раствора. Для расчета концентрации используют метод абсолютной калибровки
, который предусматривает получение калибровочной характеристики по стандартному
раствору НБ. Определение содержания нитратов по известному спо- собу представлено в табл. 3.
Относительное стандартное отклонение при получении точек калибровочной
кривой составило 0,19 - 0,25. Расчет концентрации нитратов в про
бе картофеля (пример 4) проводят по формуле JxPJA - С Р де М - количество нитрат-ионов по калибровочному графику, нг/ Р - объем бензольного экстракта, мл; Y - объем водного экстракта, мл}
S - объем вводимой в испаритель хроматографа пробы, мкл; Р - навеска продукта, г; А - объем аликвоты водного экстракта , мл;
концентрация нитратов, обусСфлавливаемая фоновым содержанием в реактивах, мг/кг. в 164942610 71ля определения фоновои концентря- ции нитратов (С) проводят анализ, .
заменяя экстракт продукта дистиллированной водой. Получают: т1 8,4 мг/кг - 8,4 31,24: i.5,7 мг/кг. Относительное стандартное отклонение при последовательных вводах проб
в хроматограф составило 0,18 (в сравнении с 0,03 в примере 1). В другую навеску измельченного картофеля (10 г) вносят добавку нитрата
в количестве 80 мг/кг (ПДК нитратов в картофеле 80 мг/кг), что соответствует
4 мкл рабочего стандартного раствора нитрата с концентрацией моль/л или 0,8 мг NOJ. Экстракцию
и очистку экстракта проводят согласно примеру 4. Получают: Crt 8,4 мг/кг
П СЈ 100
-8,4 60,6 мг/кг. Степень извлечения NO g составила СЦС1 Х1007 1U °80 36,8% (р сравнении с предлагаемым 35 способом 68,6%, пример За). Пример 4а. Определение содержания нитратов в капусте по известному способу. Экстракцию и анализ повторяют пять 40 Раз с навесками по 10 г измельченной
капусты из примера 1а согласно примеру 4. В испаритель хроматографа вводят
по 1 мкл исследуемых растворов. / Результаты представлены в табл. 4, Таким образом, применяемые приемы: очистка экстракта на активированном
угле, его разбавление и проведение реакции нитрования в стандартизированных
температурных условиях - приводят к повышению точности и воспроизводимости результатов (относительное
стандартное отклонение 0,074 в сравнении с 0,30 в известном способе ). Опыты, подтверждающие повышение воспроизводимости предлагаемого метода при использовании внутреннего
стандарта: а) в хроматограф вводят по 1 мкл стандартного раствора, содержащего 0,15 нг нитробензола. Полученные результаты представлены в табл . 5.5 б) в хроматограф вводят 0,1-0,3мкл
смеси НБ:НТ в массовом соотношении 1,5:1,7. Расчет количества НБ в смеси проводят на основе калибрбвочного
коэффициента НБ по НТ.Ю Полученные результаты представлены в табл. 6. Формула изобретения Способ количественного определения
нитратов в пищевых продуктах, вклю- , чающий экстракцию нитратов из образца
водой, нитрование бензола в присутствии серной кислоты с последующим
определением нитробензола методом газожидкостной хроматографии с детектором
электронного захвата, о т л и чающийся тем, что, с целью
повышения точности и воспроизводимости , экстракт очищают на активированном
угле, полученный элюат разбавляют в 2,5-5 раз дистиллированной водой,
полученной дистилляцией из щелочной среды, в реакционную смесь после нитрования
вводят 2-нитротолуол, а определение проводят по Формуле г/Ьнг тнт- гаф).
0 С 50 (0,5 К (пнГ/ где С - концентрация нитратов в пробе , мг/кг, К - калибровочный коэффициент, высота пика нитробензола, мм,1 высота пика внутреннего стандарта 2-нитротолуола, ммЈ
масса внутреннего стандарта, добавленного в пробу, мкг,ь масса нитратов, вносимых в
пробу с применяемыми реактивами , мкг, иг-
нт m нтт
- Таблица 1 Таблица 2 102,6 7,6 0,074 В скобках указано количество образующегося
нитробензола. Таблица Таблица 3 15 1649426 16 Таблица 6