METHOD FOR LABELING EXOSOMES WITH RADIOACTIVE SUBSTANCE AND USE THEREOF

26-11-2015 дата публикации
Номер:
WO2015178618A1
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Номер заявки: KR47-00-201578
Дата заявки: 13-05-2015

엑소좀을 방사성 물질로 표지하는 방법 및 그 용도
[1]

엑소좀을 방사성 물질로 표시하는 기술 및 그 용도에 관한 것이다.

[2]

엑소좀은 세포내에서 자연적으로 만들어지는 나노크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병진행등에 관여하고 있다. 이와 같은 생체나노소포체인 엑소좀의 경우 면역반응을 피할수 있고, 인체적합성이 뛰어나며, 약물탑재기능, 특정세포로의 표적전달효과, 혈액내 안정성등의 장점을 통해 최근 약물 전달체로 큰 관심을 받고 있다.

[3]

종래 리포좀 계열의 나노약물전달체가 임상에 응용되고 있지만, 리포좀 내 약물의 표적 전달 효율의 한계 및 병변 부위에서 적정 약물 방출 문제 등 기술적인 한계점을 드러내고 있다. 따라서 엑소좀을 인체에 투여하여 약물 전달체로서 역할을 하도록 할 경우, 엑소좀의 생체 분포 및 표적기관전달 여부를 평가하는 방법이 필요하다.

[4]

기존의 생체유래 물질이나 나노 물질의 영상추적자용 표지기술은 다양한 방법이 제시되어왔다. 하지만, 엑소좀의 경우 생체 유래 물질로서 특성을 보존하기 위한 생리학적 환경 조건에서의 표지 기술의 필요성, 표지 후 표지 된 엑소좀을 다시 획득하기 위한 절차와 안정성 유지 측면에서 일반적인 방법으로의 표지가 어렵다.

[5]

대한민국 공개특허공보 제2013-0127276호는 형광물질로 표지된 엑소좀을 이용한 엑소좀을 분석하는 방법에 관한 것으로, 형광물질로 표지된 엑소좀을 고체 지지체에 결합시켜, 엑소좀을 분석하는 방법을 개시하고 있다. 하지만 형광영상 자체의 문제인 높은 기저값(background)로 인해 살아있는 동물에서 형광기반 엑소좀을 영상으로 추적하는 것은 한계가 있다.

[6]

따라서 형광물질을 대체할 수 있는 물질로 표지되어 소동물 뿐만 아니라 사람 수준에서도 쉽게 엑소좀의 생체분포 및 표적장기 및 표적질환으로의 이동여부를 핵의학적 영상으로 관찰할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

[7]

생리적 조건에서 표지가능하며, 안정된 엑소좀의 수득이 가능한 엑소좀의 표지 방법 및 방사성 물질로 표지된 엑소좀을 제공하고자 한다.

[8]

한 양태에서 본원은 세포 유래의 엑소좀을 제공하는 단계; 및 상기 엑소좀 표면을 N-Hydroxysuccinimide-azadibenzocyclooctyne (NHS-ADIBO)로 처리하는 단계; 및 상기 처리된 엑소좀을 N3 가 도입된 킬레이터-방사성 물질과 혼합하여 상기 엑소좀 표면에 존재하는 아민기와 상기 킬레이터와의 반응을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 반응에 의해 상기 방사성 물질이 상기 엑소좀 내부로 도입되는 것인, 엑소좀의 방사성 물질 표지 방법을 제공한다. 본원에서 엑소좀은 세포밖 소포체를 의미하며, 세포 유래 물질로서 세포 밖으로 분비될 수 있는 엑소좀과 엑토좀을 포함한다.

[9]

본원의 일 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 N3 가 도입된 킬레이터는, NHS-ADIBO와 클릭 화학에 기반한 반응으로 반응할 수 있는 한 제한되지 않으며 예를 들면 NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DFO(3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2(diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA(2-(4’-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), p-SCN-Bn-DOTA(2-(4’-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA(2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO(1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), 또는HYNIC(hydrazinonicotinic acid)를 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

[10]

본원에 따른 방법에서 킬레이터는 방사성동위원소로 표지되며, 이는 양전자방출핵종인18F,68Ga,64Cu,89Zr,124I, 감마선방출핵종인99mTc,111In,123I,125I, 또는 치료핵종인67Cu,177Lu,90Y,186Re,188Re,131I를 포함한다.

[11]

본원에 따른 방법은 생리학적 환경 조건에서 예를 들면 약 pH 7.0 내지 pH 7.4에서, 인산완충용액에서 수행될 수 있다.

[12]

다른 양태에서 본원은 본원 방법의해 제조된, 방사성 물질로 표지된 엑소좀을 제공한다.

[13]

또다른 양태에서는 본원의 방법에 따라 표지된 엑소좀을 포함하는 영상화제를 포함하며, 이러한 영상화제는 치료물질을 추가로 포함할 수 있다.

[14]

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 영상화제를 인비트로의 세포 또는 개체에게 투여하는 단계; 및 상기 투여된 영상화제의 분포 및 이동을 방사선 영상 기법을 이용하여 분석하는 단계를 포함하는, 영상화 방법을 제공한다.

[15]

본원의 방법은 생체 유래 물질로서 특성을 보존하기 위한 생리학적 환경 조건에서 엑소좀의 쉽고 빠르며 안정적인 표지가 가능하여, 본원의 방법에 따라 제조된 엑소좀은 인간을 포함하는 동물에서 엑소좀의 생체분포를 비침습적으로 획득할 수 있고, 표적장기 및 표적질환으로의 이동여부를 핵의학적 영상, 치료영상제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

[16]

도 1은 N3 아자이드 와 ADIBO 화합물 사이의 클릭반응의 모식도이다.

[17]

도 2a는64Cu-표지된 엑소좀의 TLC (Thin layer chromatography) 분석결과이다. 도 2a에서 1) N3-PEG4-NOTA에64CuCl3 표지 그룹; 2) N3-PEG4-NOTA-64Cu + ADIBO-exosome 그룹; 3) N3-PEG4-NOTA-64Cu + ADIBO-exosome반응 후 PD-10으로 분리 후 측정한 것을 나타낸다.

[18]

도 2b는64Cu-표지된 엑소좀의 혈청내 안정성을 측정한 결과이다.

[19]

도 3a는 엑소좀 모방체 나노소포 (nanovesicle, NV)를99mTc-HMPAO 로 표지하는 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.

[20]

도 3b는99mTc-표지된 엑소좀의 TLC (Thin layer chromatography) 분석결과로, 엑소좀은 시작점에 남아있으며, 자유99mTcO4- 또는99mTc-HMPAO는 용매와 함께 이동한다.

[21]

도 4a는99mTc--HMPAO-엑소좀을 마우스에 투여한 후 30분, 3시간 및 5시간째에 SPECT/CT를 이용하여 생체 분포도를 촬영한 것이다.

[22]

도 4b는 대조군으로서99mTc-HMPAO를 마우스에 투여시의 생체분포도를 촬영한 것이다.

[23]

도 4c는99mTc-HMPAO-엑소좀을 마우스에 투여시 생체 분포도를 그래프로 나타낸 것이다.

[24]

도 5는 본원의 일 구현예에 따라 제조된 엑소좀을 이용하여 수행된 글루타치온 분석결과로서, 0.1mg의 엑소좀 시료를 사용한 경우, 3.15±0.16nmol의 글루타치온이 검출되는 것으로 나타났으며, 적색 선은 이미 알려진 글루타치온 농도를 이용하여 작성된 표준곡선을 나타낸다. 결과는 평균 ± SD로 나타냈다.

[25]

[26]

본원은 엑소좀 표지와 관련된 것으로 엑소좀의 이중지질막을 자유롭게 통과할 수 있는 물질이 포획되어 영상화 등의 기술을 이용한 추적에 사용할 수 있다는 것과, 엑소좀의 표면에 존재하는 아민기와 동위원소와 결합된 킬레이터와의 반응을 통해 동위원소를 엑소좀 내부로 도입하는 방식으로 표지가 가능하다는 발견에 근거한 것이다.

[27]

따라서 한 양태에서 본원은 세포 유래의 엑소좀을 제공하는 단계; 및 상기 엑소좀 표면을 N-Hydroxysuccinimide-azadibenzocyclooctyne (NHS-ADIBO)로 처리하는 단계; 상기 처리된 엑소좀을 상기 엑소좀 표면에 존재하는 아민기와 반응할 수 있는 킬레이터-방사성 물질과 반응하는 단계를 포함하며, 상기 반응에 의해 상기 방사성 물질이 상기 엑소좀 내부로 도입되는 것인, 엑소좀의 방사성 물질 표지 방법에 관한 것이다.

[28]

엑소좀은 세포내에서 자연적으로 만들어지는 나노크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병진행등에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 다양한 세포로부터 당업계에 공지된 기술 또는 본원 실시예에 기재된 방법 등을 참조하여 분리될 수 있다.

[29]

본원의 방법에서 엑소좀의 표면의 자유 아민기 (NH2)는 방사성동위원소와 연결된 킬레이터와 반응한다. 자유 아민기 (NH2)와 반응할 수 있는 한, 임의의 물질이 사용될 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), DFO(3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2(diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA(2-(4’-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), p-SCN-Bn-DOTA(2-(4’-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA(2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO(1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea),HYNIC(hydrazinonicotinic acid) 등을 포함하는 킬레이터와 이에 표지된 방사선 물질의 예는 양전자방출핵종인18F,68Ga,64Cu,89Zr,124I과 감마선방출핵종인99mTc,111In,123I,125I, 또는 치료핵종인67Cu,177Lu,90Y,186Re,188Re,131I의 방사성동위원소를 포함한다.

[30]

본원의 방법에 따라 표지된 엑소좀은 방사성 물질을 포함하는 미량의 물질이 막을 통과한 후 대사되어 밖으로 빠져나오지 못하며, 엑소좀 내부에 방사성 물질이 자리하여 안정적 표지가 가능하여 영상화 등에 유용하게 사용될 수 있다.

[31]

본원에 따른 방법에서, NHS-ADIBO로 처리된 엑소좀과 킬레이터-방사성 물질과의 반응은 약 pH 7.0 내지 pH 7.4 에서 수행될 수 있다. 특히 약 pH 7.0 내지 pH 7.4 의 인산완충용액에서 수행될 수 있다. N3 작용기를 지닌 킬레이터와 ADIBO 화합물의 반응 (클릭 화학, click chemistry) 은 중성 pH 조건, 예를 들면 pH 7.0 내지 pH 7.4 및 상온에서 진행될 수 있으며, 이 경우 엑소좀의 물성을 변화시키지 않고 효과적으로 표지할 수 있다.

[32]

클릭화학은 원하는 특정 물질을 얻기 위해 서로 다른 구성부분을 만들고 이들 구성부분들을 간단하고 빠르게 붙이는 일반적 방법을 의미하며, 특정 구체적인 화학반응을 지칭하는 것은 아니다.

[33]

따라서, 다른 양태에서 본원은 또한 본원의 방법에 따라 제조된 엑소좀 및 이를 포함하는 영상화 조성물 또는 영상화제에 관한 것이다.

[34]

본원에 따른 영상화제는 분석이나 치료의 목적으로 인간을 포함한 동물의 생체내로 투입되는 세포의 위치, 분포를 영상화에 사용될 수 있고, 따라서, 세포수준의 정상 및/또는 이상 정보, 시간에 따른 진척 상황과 이동 및 추이 결과 등을 장기간에 걸쳐 효과적으로 얻을 수 있다. 즉, 투입되는 세포에 대한 표적영상화를 가능하게 하므로, 예들 들어, 줄기세포 등을 투여하는 세포치료 등에서 세포의 발현, 이동경로의 추적에 용이하게 사용될 수 있다.

[35]

본원의 영상화제와 사용가능한 방사성 영상 기법은 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 단광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 감마 카메라 촬영 등을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.

[36]

본원에 따른 영상화제는 영상검사기반의 치료를 시행하기 위한 기술로서, 약물 또는 유전체 전달을 모니터링하며 이용할 수 있고, 독성을 나타내기 어려운 극미량의 표지로서 체내 분포 및 병변 부위의 표적화가 가능하여 빠른 임상적용이 가능하다.

[37]

이런 관점에서 본원에 따른 엑소좀은 또한 그 내부에 치료제를 포함하여, 치료영상제로서 사용될 수 있다. 치료영상제란, 예를 들면 암과 같은 치료약제에 영상기능을 부여하여 암의 치료와 영상촬영을 통한 암의 모니터링을 동시에 할 수 있는 시각화가 가능한 치료용 탐사물질(imageable therapeutic probe)을 의미한다. 또한 치료(therapy)와 진단(diagnosis)이 한번에 가능하여 치료진단제(theragnosis)를 의미하는 것이기도 하다.

[38]

본원의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 임의의 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장제, 투여 증진제 및 흡수 지연제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 또한, 상술한 바와 같은 치료제와 같은 추가의 활성 성분을 조성물에 도입할 수 있다. pH 및 정확한 농도는 공지된 요인에 따라 조정될 수 있다. 또한, 방사성 영상 기법의 촬영에 요구되는 소정을 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 수, 의학 분야에서 사용되는 일반적 경로를 통해 투여될 수 있으며, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.

[39]

다른 양태에서 본원은 또한 상기 언급한 본원에 따른 엑소좀, 이를 포함하는 영상화 조성물 또는 영상화제를 개체에게 투여하는 단계; 상기 투여된 영상화제의 분포 및 이동을 방사선 영상 기법을 이용하여 분석하는 단계를 포함하는, 영상화 방법을 제공한다.

[40]

본원의 방법이 적용될 수 있는 개체는 인간을 포함하는 포유 동물이다. 예들 들어, 소, 양, 염소, 암소, 돼지 등과 같은 가축; 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금; 개, 고양이 등과 같은 애완동물; 설치류 (예컨대 마우스, 랫트, 햄스터), 토끼 등을 포함할 수 있다.

[41]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[42]

실시예

[43]

실시예 1. 엑소좀의 제조

[44]

엑소좀은 높은 수율의 엑소좀 획득이 가능한 종전에 기술된 바와 같이 제조되었다 (Jang et al.,ACS Nano 2013 24;7:7698-710.).

[45]

구체적으로 엑소좀이 제거된 FBS(소태아혈청)는 150,000g로 4℃에서 16시간 동안 초원심분리를 수행하여 제조하였다. Raw264.7 세포 (마우스 유래 대식세포)는 10%의 엑소좀이 제거된 FBS를 포함하는 RPMI 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어 상기 배양된 세포를 수확하여 4℃ 인산완충용액(PBS - NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L Na2NPO4 10mmol/L, KH2PO4 1.8mmol/L) 중에서 초음파로 파쇄한 후 이어 세포잔해를 비롯한 세포는 500g에서 10분간 그리고 3000g에서 15분간 연속적으로 원심분리를 수행하여 제거하였다. 최종적으로 엑소좀 펠렛은 150,000g로 4℃에서 2시간 동안 초원심분리를 수행하여 수득하고, PBS에 재현탁하였다. 단백질은 브래드포드 분석법으로 정량하여, 최종농도를 PBS 중에 1mg/ml로 맞추었다.

[46]

실시예 2. 엑소좀의64Cu 또는68Ga 또는99mTc(Technetium)으로의 표지

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우선 아민과 NHS-ester 반응을 이용하며 엑소좀 표면에 ADIBO-NHS를 합성하였다. 이를 위해 실시예 1에서 분리된 -80도에 보관중인 엑소좀 (1 mg/mL)을 부터 200-500 μg 이 되도록 분주하였다.

[48]

이어 최종 반응 혼합물의 부피 1mL에서 ADIBO-NHS (퓨처켐, 대한민국) 가 80 μM 이 되도록 ADIBO-NHS를 DMSO 중에 녹였다. 즉 3 mg 의 ADIBO-NHS를 1 mL 의 DMSO 에 녹인 후 10 μL를 취하여 넣어주면 1 mL 에 80 nmole 의 ADIBO-NHS가 포함된다.

[49]

모든 반응은 얼음위에서 수행하였다. 위의 엑소좀 용액을 1xPBS를 통해 1mL로 부피를 맞춘 후 DMSO에 녹인 ADIBO-NHS를 10 μL를 넣어주고, 37℃에서 30 분간 반응하였다. 이어 Opti-prep (Sigma-Aldrich, USA)을 제조자의 방법대로 이용하여 농도구배 방식으로 자유 ADIBO-NHS를 분리하였다. 요약하면, 슈크로스 농도구배를 50 % Opti-prep 과 10 % Opti-prep을 준비하고 5 mL 시험관에 넣었다. 이때 0.5 mL 50 % Opti-prep, 1 mL 10 % Opti-prep 순으로 넣어주었다. 여기에 반응한 엑소좀을 1xPBS를 이용하여 3mL 로 맞추어 마지막으로 넣어주었다. 이어 100,000 g에서 2시간 동안 초원심분리를 수행하였다 (100,000 g = 32 Krpm). 그 결과 0.5 mL 50 % Opti-prep, 1 mL 10 % Opti-prep 사이에서 ADIBO-EXO를 수득하였으며, 이의 단백질 농도를 측정하고 -80도에 사용시까지 보관하였다.

[50]

이어 상기 수득한 ADBIO-EXOSOME에64Cu 또는68Ga로 표지된 N3-PEG4-NOTA를 결합하였다.

[51]

우선 N3-PEG4-NOTA (1 mg/mL)(퓨처켐) 10 μL(10 nmole) 을 준비하였다. N3-PEG4-NOTA를 동위원소로 먼저 표지하기 위해 준비된 10 nmole N3-PEG4-NOTA에 1 M 소디움 아세테이트 완충액 중의 200 uCi64CuCl3 (또는68GaCl3)를 총 부피 200 μL로 혼합하여 pH 5, 37℃ 교반 반응기에서 10분간 반응하였다. 이어 표지된 N3-PEG4-NOTA-64Cu 20 μL를 준비하고, 2M NaOH을 사용하여 pH 7로 맞춘 후 여기에 1xPBS 에 분산된 50μL ADIBO-EXOSOME를 넣고 반응을 수행하였다. 이어 크기배제 컬럼인 PD-10 column (GE Healhcare, USA)을 이용하여 반응에 참여하지 않은 자유64Cu 또는 N3-PEG4-NOTA-64Cu를 제거하였으며, 이를 위해 37℃ 교반 반응기에서 20 분간 반응하고 iTLC-SG (Instant Thin Layer Chromatography-Silica Gel)를 Whatman no. 1 paper를 0.1 M 시트르산으로 전개하여 박막크로마토그래피 데이터를 수득하여 표지 효율을 측정하였다.

[52]

결과는 도 2a에 기재되어 있다. TLC결과 N3-PEG4-NOTA-64Cu 고유의 50 mm의 이동거리를 확인하였고, 100-120 mm사이에서 free64Cu 피크를 확인할 수 있었다. 다음으로64Cu가 표지된 N3-PEG4-NOTA에 ADIBO-exosome을 반응하였을 때, 20 mm이동거리에서 고유의64Cu가 표지된 엑소좀 피크가 관찰되었다. 하지만, N3-PEG4-NOTA-64Cu 피크 및 자유64Cu peak도 관찰되어 N3-PEG4-NOTA-64Cu + ADIBO-exosome 반응 후 PD-10으로 N3-PEG4-NOTA-64Cu 및 free64Cu를 제거한 후 TLC측정하였을 때, 99%의64Cu가 표지된 엑소좀을 확인할 수 있었다. 따라서 본 방법을 이용하여 엑소좀 표면에 빠르고 간단히 동위원소를 표지할 수 있다.

[53]

68Ga 표지의 경우, 위와 동일하나 50 uCi의68Ga를 사용하였으며 총 부피를 100μL로 하였다.

[54]

99mTc 표지를 위해 헥사메틸프로필렌아민 옥심 (hexamethylpropyleneamine oxime) 또는 HAMPAO 키트를 사용하였다. 이의 반응은 도 3a에 도시적으로 나타냈다. HAMPAO 키트 (동아제약, 서울)는 메틸렌블루의 부재 하에서 제조사의 방법에 따라99mTc로 표지되었다. 실시예 1에서 제조된 엑소좀 50μg을 상기 제조한 185 MBq 의99mTc-HMPAO와 실온에서 60분간 배양하였다. pH는 생물학적 조건과 같은 7.4였다.99mTc-HMPAO는 엑소좀 안으로 이입되며, 글루타치온의 설프하이드릴 기와의 반응으로 인해 엑소좀 안에서 비가역적으로 포획된다. 이어 엑소좀은 자유99mTcO4-or99mTc-HMPAO로부터 PD-10 컬럼 (GE Healthcare, USA)을 이용하여 0.9% w/v 염화나트륨 용액으로 용출되어 분리되었다. 용출액을 0.5ml의 양으로 시험관에 수집하였다. 표지의 효율은 Whatman no. 1 paper 및 0.9% w/v NaCl 용액을 전개액으로 사용한 박막크로마토그래피(TLC)로 분석하였다.

[55]

결과는 도 3b에 기재되어 있다. 이에 기재된 바와 같이 TLC 상에서 엑소좀은 시작점에 잔존하였으며, 자유99mTcO4- 또는99mTc-HMPAO는 용매와 함께 이동하는 것으로 나타났다. 방사화학적 순도는 93.78%로 측정되었다. 해당 표지 엑소좀의 혈청내 표지 안정성은 10분 째 92.8%, 30분 째 90.6% 그리고 1시간 째 71.2%로 측정되었다.

[56]

또한64Cu가 표지된 엑소좀의 생체적용을 위한 선행연구로서 혈청내 안정성을 측정하였다. 인간 혈액으로부터 혈청을 분리하여, 상기 실시예에서 제조된64Cu가 표지된 엑소좀을 혈청과 실온 (섭씨 25도의 실험실내 온도) 에서 1, 2, 및 20시간 반응하였다. 결과는 박막크로마토그래피로 분석하였다.

[57]

결과는 도 2b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 혈청에서 1시간 반응시켰을 경우, 93%의 안정성을 확인하였고, 2시간이 지난 후에도 92%의 높은 안정성을 관찰할 수 있었다. 또한 20시간 후에도 혈청내 83%라는 높은 안정된 결과를 확인하였다. 이는 본원의 방법에 의해 제조된 엑소좀 표지 방법의 우수한 안정성을 나타내는 것이다.

[58]

실시예 3.99mTc 표지된 엑소좀을 이용한 SPECT/CT

[59]

실시예 2에서 제조한 0.2-0.4 mCi 의99mTc -HMPAO-엑소좀을 총 3마리의 마우스 (Balb/c종, 오리엔트바이오, 20-25 g, 10-15 주령)의 꼬리 정맥에 주사하였다. SPECT/CT 촬영은 SPECT/CT scanner (NanoSPECT/CT, Bioscan, Washington, DC)을 이용하여 투여 후 30분, 3시간 및 5시간째에 수행되었다. 모든 마우스를 마취하였으며, 마취상태는 1 L/min로 산소 공급하에서 1.5% 이소플루란으로 유지하였고, 마우스는 스캐너에 엎드린 상태로 두었다. 고대비 콜리메이션이 가능하도록 4개의 멀티핀홀 γ-검출기 (9-pinholes)를 사용하였다. 추가로 해부학적 위치 확인을 위해 SPECT 후에, 추가로 CT 스캔을 수행하였다. 영상획득시간은 프로젝션당 30,000 카운트를 초과하도록 조정하였다. SPECT 영상의 경우, 24개 프로젝션을 512 × 512 획득 매트릭스로 수득하였다. 영상을 이어 OSEM (3-Dimensional Ordered-Subsets Expectation Maximum) 알고리즘을 이용하여 재구축하였다. 장기의 방사선은 SPECT 영상에서 추정된 장기의 상대적 카운트와 비교하여 VOI (Volume of Interest)로 계산되었다. 카운트는 % ID/g으로 적정화 (normalize)되었다.

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또한 마우스는99mTc -HMPAO-엑소좀 투여 후 각각 0, 1, 3 및 5 시간째에 희생하여 방사능을 측정하여 생체분포를 정량적으로 분석하였다.

[61]

결과는 도 4a, 4b 및 4c에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 표지된 엑소좀은 간, 비장, 및 신장에 축적되는 것으로 나타났으며,99mTc -HMPAO 대조군과 달리 뇌에서는 유의적으로 검출되지 않았다.

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이러한 결과는 본원의 엑소좀의 표지 방법을 통해 비침습적인 방법으로 시간에 따라 반복적인 생체 분포 영상을 획득 할 수 있으며, 이는 약물로서의 엑소좀을 사용하기 위해 표적 장기나 특정 표적 장기의 엑소좀 전달 여부를 직접적으로 영상으로 평가할 수 있다는 것을 의미한다.

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또한 엑소좀이 내인성 글루타치온을 수반(carry)할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 상기와 같이 엑소좀이 투여된 마우스 Raw 264.7 대식세포주에서 생산된 엑소좀을 OptiPrep 밀도구배 분획 (Sigma-Aldrich, USA)을 제조자의 방법대로 이용하여 정제하였다. 결과는 도 5에 기재되어 있다. 엑소좀중의 글투타치온을99mTc-HMPAO 표지여부로 측정하였으며, 0.1mg 중에 3.15±0.16nmol의 글루타치온이 검출되는 것으로 나타났다.

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이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

[66]

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.



[1]

Disclosed are: a method for labeling exosomes with a radioactive substance using amine groups on surfaces of the exosomes; exosomes prepared thereby; an imaging composition comprising the same; and an imaging method. According to the method of the present application, the exosomes can be stably labeled at high labeling efficiency, and the exosomes prepared by the method of the present application can be favorably used as an agent for nuclear medicine imaging and therapeutic imaging for confirming the biological distribution of exosomes and the migration or not of exosomes to target organs and target diseases in animals including a human being.

[2]



세포 유래의 엑소좀을 제공하는 단계;

상기 엑소좀 표면을 NHS-ADIBO (N-Hydroxysuccinimide-azadibenzocyclooctyne)로 처리하는 단계; 및

상기 처리된 엑소좀을 N3 가 도입된 킬레이터-방사성 물질과 혼합하여 상기 엑소좀 표면에 존재하는 아민기와 상기 킬레이터와의 반응을 수행하는 단계를 포함하며, 상기 반응에 의해 상기 방사성 물질이 상기 엑소좀 내부로 도입되는 것인, 엑소좀의 방사성 물질 표지 방법.

제 1 항에 있어서,

상기 N3 가 도입된 킬레이터는, 하기로부터 선택되는 것인, 방법:

NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DFO(3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2(diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA(2-(4’-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), p-SCN-Bn-DOTA(2-(4’-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA(2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO(1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), 또는HYNIC(hydrazinonicotinic acid).

제 1 항에 있어서,

상기 킬레이터에 연결된 방사성동원원소는18F,68Ga,64Cu,89Zr,124I, 감마선방출핵종인99mTc,111In,123I,125I, 또는 치료핵종인67Cu,177Lu,90Y,186Re,188Re,131I 중 어느 하나인 방법.

제 1 항에 있어서,

상기 처리된 엑소좀과 킬레이터-방사성 물질과의 반응은 pH 7.0 내지 pH 7.4 에서 수행되는 것인, 방법.

제 4 항에 있어서,

상기 처리된 엑소좀과 킬레이터-방사성 물질과의 반응은 인산완충용액에서 수행되는 것인, 방법.

제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된, 방사성 물질로 표지된 엑소좀.

제 6 항에 따른 엑소좀을 포함하는 영상화제.

제 7 항에 있어서,

상기 엑소좀은 치료물질을 추가로 포함하는 것인, 영상화제.

제 7 항에 따른 영상화제를 인비트로의 세포, 조직, 장기 또는 개체에게 투여하는 단계; 및

상기 투여된 영상화제의 분포 및 이동을 방사선 영상 기법을 이용하여 분석하는 단계를 포함하는, 영상화 방법.