THREE-DIMENSIONAL CELL CULTURE CONTAINER

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시 예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭하며, 길이 및 면적, 두께 등과 그 형태는 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다.

이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시 예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따르는 세포배양용기는 하판(120); 상기 하판의 상측에 구비되는 둘 이상의 기둥(110)으로 이루어진 배리어부; 상기 배리어부의 개방된 단부를 마감하는 상판(130); 상기 상판의 일측에 구비된 세포시료 주입 가이드부(220);를 포함한다.

본 발명의 세포배양용기는 유리(glass)를 포함하는 투명 세라믹류, 폴리디메틸실록세인(PolyDiMethylSiloxane; PDMS)과 에코플렉스(ecoflex) 중 적어도 하나를 포함하는 실리콘고무류, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 폴리우레탄(polyurethane), 중 적어도 하나를 포함하는 엔지니어링 플라스틱류, 투명 세라믹류, 실리콘고무류와 엔지니어링 플라스틱류 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물, 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체, 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체, 또는 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체와 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체 중 하나 또는 적어도 두 개를 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 광경화형 플라스틱류, 필름, 열가소성 플라스틱 및 금속 등 3D 프린터 소재로 이용될 수 있는 소재를 하나 이상 포함하거나 이의 화학적 변형체를 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따르는 세포배양용기의 세포 시료 주입부는 세포배양용기 구성의 일 측면에 위치할 수 있다. 세포 시료 주입부는 세포 시료를 주입하는 파이펫, 주사기 니들 등의 토출구를 가이드 할 수 있도록 바람직하게는 원형의 홀 구조를 갖는다. 또한 시료 주입구 주위로 시료가 기둥 밖으로 빠져 나가지 않고, 배양부 내부로 향하여 채워지도록 액체의 흐름을 가이드 하는 배리어 구조체가 포함될 수 있다.

본 발명에 따르는 세포배양용기의 다수개의 기둥부는 젤 형태의 세포시료가 그 표면장력에 의하여 기둥부 내부에 안착하는데 적절할 정도의 간격을 갖으며, 기둥의 간격은 10㎛ 에서 2,000㎛, 기둥의 지름은 20㎛ 에서 2,000㎛ 정도로 가능하다. 배리어 역할을 하는 기둥부는 기둥의 지름이 작을수록 기둥간의 간격도 작아지는 경향이 있다. 하지만 너무 좁은 간격은 세포와 배양액 사이의 물질 교환을 하는데 제약이 생기거나, 기포가 틈 사이에 형성될 가능성이 높아 질 수 있고, 너무 큰 간격은 기둥과 시료 간 표면에너지와 장력 간 균형이 깨지면서 시료가 기둥 밖으로 빠져 나갈 가능성이 높아진다. 실시 예에서처럼, 기둥의 지름이 300 ㎛일 때, 각 기둥간의 간격이 약 200㎛에서 400㎛ 사이가 적절하며, 세포시료가 내부에 안착하는데 적절하다. 또한 기둥의 개수는 세포시료를 내부에 안착시킬 수 있는 공간을 구성하기에 적절한 숫자로 구성되며 1개 이상 100개 이하가 적절하다. 기둥의 단면은 원형 외에 다각형 등 계면 장력을 조절할 수 있는 다양한 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따르는 세포배양용기의 형태는 바람직하게는 원형 혹은 원형외에 다른 형태도 무방하다. 배양부의 폭은 물질교환이 충분히 일어나 내부의 세포에 전달하는 산소와 영양분이 공급이 원활하게 일어날 수 있는 크기여야 하며, 세포 배양부가 원형일 때 그 지름을 기준으로 0.1mm에서 10mm 정도로 가능하다. 크기가 너무 작으면 충분한 양의 세포시료를 공급하기 어려우며, 너무 큰 지름(배양부가 다각형일 때 내접원의 지름)은 측면으로의 물질전달에 제약이 있어 세포배양기로서 적합하지 않다.

본 발명에 따르는 세포배양용기의 상판은 기둥부에 직각으로 연결되어 바닥면과 평행을 이루는 형태일 수 있다. 상판과 바닥면과의 높이는 세포 배양 결과물을 현미경으로 관찰하기에 적절한 간격을 갖도록 하며, 0.05㎜에서 5㎜ 사이가 적절하다. 0.05㎜ 이하일 경우 관찰범위 내에 관찰 대상 세포 수의 충분한 확보가 어려우며, 5㎜ 이상일 경우 관찰 대상이 되는 세포의 중첩 등의 문제로 현미경으로 세포 배양 결과를 관찰하기에 부적절하다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예1. 바람직한 기둥부 간격 도출

일반적으로 사용되는 젤 형상의 세포시료와 용기 표면과의 표면에너지를 고려하여 세포시료가 용출되지 않고 다수개의 기둥으로 일루어진 배리어 내에 고정되기에 적절한 기둥 간 간격 도출을 위하여 기둥간의 간격을 200㎛에서 400㎛까지 100㎛ 간격으로 두고 세포시료 로딩 실험을 수행하였다. 주입 시료는 콜라겐 2mg/ml를 이용하였고, 이때 기둥의 지름은 300㎛로 하였다. 상판과 바닥면의 두께 (시료의 두께)는 250 ㎛으로 고정되었다.

실험결과, 도4에서 확인할 수 있는 바와 같이 200㎛에서 400㎛로 기둥 간의 간격이 커질수록 젤 시료의 계면이 기둥 바깥쪽으로 돌출되는 경향이 보인다. 즉 더 큰 간격에서는 시료가 기둥 밖으로 샐 수 있으므로 기둥의 지름 및 배양부의 지름에 따라 최적의 간격이 필요하다. 본 실험에서는 기둥지름을 300㎛으로 고정하였을 때 200㎛에서 400㎛ 사이의 기둥 간 간격에서는 젤 형태의 세포시료가 기둥 밖으로 용출되지 않고, 그 장력에 의하여 기둥으로 이루어진 배리어 내부에 적절하게 위치하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 용기 표면의 친수성 정도에 따른 시료주입의 성공률

본 실험에서는 세포배양기와 기둥 표면을 친수성으로 처리 (플라즈마 처리)한 후, 용기내로 주입되는 시료가 내부로 잘 안착되는 지 성공률을 조사하였다. 플라즈마 처리한 직후는 용기의 표면에너지가 높은 친수성이며, 시간이 지날수록 점차 소수성을 회복한다, 기둥 표면이 친수성일 때 시료의 젖음성이 좋아져서 시료가 기둥 밖으로 흘러나오기 쉽고, 시료 로딩 실패율이 높아지며, 소수성을 회복할수록 액체의 표면장력에 의해 시료 로딩의 성공률이 높아지게 된다. 본 실험에서는 기둥의 간격, 주입부 지름이 로딩에 미치는 효과를 극대화하기 위하여, 기둥 표면을 친수성으로 처리한 지 8시간 이내에 로딩에 얼마나 성공하는지를 확인하였다. 이 실험에서, 시료가 하나 이상의 기둥 밖으로 빠져나가면 실패, 기둥 안으로 성공적으로 안착하면 성공으로 정의하였다. 도 5(a)는 친수성 표면에서 시간의 변화에 따라 시료의 로딩에 성공하는 확률을 나타낸다. 그림에서와 같이 시간이 지남에 따라 친수성에서 소수성으로 변해가면서 시료의 로딩 성공률은 점차 높아져 8시간 이후에는 100%에 가까움을 보여준다. 이는 기둥 구조가 시료 로딩의 성공이 가능함을 보여준다. 도 5(b)에서는 세포배양부의 지름의 크기가 로딩성공률에 미치는 영향을 알아보았다. 매우 친수성인 표면 (1h, time after plasma treatment)에서 배양부의 지름이 클수록 시료가 배양부 내에 최종 채워지기 전에 주변 기둥 밖으로 용액이 새는 확률이 높아짐을 관찰하였다. 이는 소수성을 회복하는 시간에 따라 점차 줄어들어, 8시간 이후에는 지름크기에 상관없이 로딩 성공률이 100%에 달했다. 또한 도 5(c) 배양부 주변 기둥부의 간격에 따른 시료 로딩확률을 측정하였다. 마찬가지로, 매우 친수성인 표면에서 (1h, time after plasma treatment)에서 기둥 간 간격이 클수록 시료가 기둥 밖으로 새는 확률이 높음을 확인할 수 있었으며, 이는 시간이 지날수록 줄어들어 소수성이 회복되는 8h 이후에서는 간격에 상관없이 실패율이 거의 없었다. 이를 통해, 기둥부의 간격과 배양부의 지름이 세포 로딩 성공률에 미치는 효과를 확인할 수 있었으며, 표면에너지가 높지 않은 표면에서 세포 로딩의 확률이 거의 100%에 달해 매우 효과적으로 세포 시료를 채울 수 있음을 증명하였다.

실시예 3. 세포의 배지와의 물질교환 확인을 통한 세포 주입부 크기 도출

다수개의 기둥으로 이루어진 배리어 내부에 있는 세포시료와 배지의 물질교환이 적절하게 이루어질 수 있는 수준의 세포 주입부 크기 도출을 위하여 세포 로딩부의 지름을 2㎜에서 5㎜까지 1㎜ 간격으로 두고 물질교환 실험을 수행하였다. 상판과 바닥면의 두께 (시료의 두께)는 250 ㎛으로 고정되었다.

세포는 ReN-VM(Neural stem cell)을 이용하였으며, 세포 배양조건 및 관찰 기준은 아래와 같다.

Nameof cell: ReN-VM (Neural stem cell)

Matrigel concentration. : 5.7 mg/ml

Cell concentration. : 1.0 x 10⁷ cells/ml

Culture period : 1 week

Staining method : FITC-phalloidin, 50 min

실험결과, 도6에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포배양부의 지름이 2㎜에서 4㎜까지는 세포 배양부 전체에서 신경줄기세포가 주입된 젤 환경과 배양액에 의해서 분화가 잘 일어나고 있음을 확인할 수 있었다. 이는 곧 시료 전체 범위에서 배지와 물질교환이 원활하게 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 50분간 염색한 제한된 시간에서 살펴보면, 염색액이 퍼지는 정도는 5mm 세포배양부에서 가장 불균일하게 보인다. 이는 곧 세포배양부의 지름이 무한정 커지는 데 제약이 있을 수 있음을 의미한다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.