NOVEL OCT-3/4 VARIANT
본 발명은 Oct-3/4 단백질의 변이체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 Oct-3/4 단백질의 특정 부위의 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환한 Oct-3/4 단백질의 변이체에 관한 것이다. Oct-3/4는 유전자 활동을 조절하는 단백질 전사인자의 하나로서 줄기세포가 몸체의 조직을 형성하는 능력을 유지하도록 한다. 또한, 줄기세포에 특이하게 작용하는 Oct-3/4 단백질은 일반적인 세포 분화나 혹은 세포가 더욱 특별하게 분화하도록 하는 어떤 유전자들의 마중물 역할을 한다. 2007년, Yamanaka 연구팀과 Thomson 연구팀은 역분화 인자인 Oct-3/4를 사용하여 역분화 줄기세포를 제작함으로서 Oct-3/4가 역분화 줄기세포를 유도하는 핵심인자인 것을 밝힌 바 있다(Takahashi, K., & Yamanaka, S. (2006). Cell, 세포 증식 및 분화에 관여하는 주요 단백질들이 유비퀴틴-프로테아좀 과정(ubiquitin-proteasome pathway; UPP)에 의해 조절된다는 연구들이 점차 알려짐으로써 단백질 분해기전 연구의 중요성이 점차 증가되고 있다. 세포내 대부분의 단백질의 경우, 유비퀴틴(ubiquitin)에 의해 표지되어 UPP를 통해 단백질의 항상성을 유지하게 되며, 이 기작의 이상은 암 등 여러 질병과 밀접한 관련이 있음이 다양하게 보고되고 있다(Naujokat, C., & Saric, T. (2007). 최근 본 발명자들을 비롯한 일부 연구팀들은 증식 및 분화와 관련된 중요한 단백질이 UPP에 의해 항상성이 조절된다는 것을 규명한 바 있다(Choi, J., & Baek, K.H. (2017). 본 발명자들은 Oct-3/4 단백질의 유비퀴틴화 기전을 밝혀내기 위해 bioinformatics 분석을 포함한 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, Oct-3/4 단백질의 특정 아미노산 잔기, 즉 Oct-3/4 단백질의 156번, 및 286번의 라이신을 아르기닌으로 치환한 단백질 변이체가 유비퀴틴화를 통한 단백질 분해기작을 억제할 뿐만 아니라 높은 반감기를 나타냄으로써 높은 안정성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 Oct-3/4 단백질 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질에 있어서, 156번의 라이신; 286번의 라이신; 또는 156번 및 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Oct-3/4 단백질 변이체가 제공된다. 일 구현예에서, 상기 Oct-3/4 단백질 변이체는 서열번호 3, 4, 또는 5의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다. 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 유비퀴틴화를 통한 단백질 분해기작을 억제할 수 있으며, 야생형(wild type) Oct-3/4에 비해 높은 반감기를 나타냄으로써 높은 안정성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 변이체는 효과적으로 Oct-3/4를 발현시킬 수 있으므로, 역분화 줄기세포 제작 등에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 배상체(embryonic body, EB)로부터, 외배엽(ectoderm)으로 분화되는 신경 세포(neuron cell), 중배엽(mesoderm)으로 분화되는 심근 세포(cardiac muscle), 및 내배엽(endoderm)으로 분화되는 췌장 세포(pancreatic cell) 등을 타깃으로 세포의 분화기전에 관여하는 Oct-3/4 단백질의 분해기작 억제를 통해 치료에 필요한 방향의 표적 세포를 특이적으로 생산될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 높은 반감기를 나타냄으로써 높은 안정성을 가지므로 대량 생산이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있으므로, 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다. Oct-3/4는 암세포에서 높은 발현양을 보인다. Oct-3/4 변이체에 작용하는 E3 ligase는 아직 밝혀진 것이 없으며, E3 ligase를 통해 조절되는 Oct-3/4 단백질의 발현은 암세포의 증식을 억제하며 이는 세포치료제에 유용하게 사용될 수 있다. 도 1은 HA-표지된 유비퀴틴화 효소 및 Flag로 각각 표지된 야생형 Oct-3/4 또는 Oct-3/4 변이체(Oct-3/4 K128R, Oct-3/4 K144R, Oct-3/4 K156R, 또는 Oct-3/4 K286R)를 293T 세포에 형질감염(transfection)한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과(상부 패널)와 Flag 항체로 면역침강법을 수행한 결과(하부 패널)를 나타낸다. 도 2는 야생형 Oct-3/4, Oct-3/4 K156R 및 Oct-3/4 K286R 각각을 293T 세포에 형질감염(transfection)한 뒤 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide, CHX)를 처리한 후, 0시간부터 1시간 간격으로 3시간까지의 Oct-3/4 발현량을웨스턴 블롯팅을 통하여 측정한 결과를 나타낸다. 도 3은 도 2의 결과로부터 0시간부터 3시간까지의 상대적인 Oct-3/4 발현량을 계산한 결과를 나타낸다. 본 발명자들은 Oct-3/4 단백질의 유비퀴틴화 부위를 찾기 위하여 bioinformatics 분석을 수행하였으며, 특정 부위의 라이신 즉, 128번, 144번, 156번, 및 286번 라이신 부위가 Oct-3/4 단백질의 유비퀴틴화와 관련될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 또한, 상기 결과로부터 128번, 144번, 156번, 또는 286번 라이신을 각각 아르기닌으로 치환한 Oct-3/4 변이체(즉, Oct-3/4 K128R, Oct-3/4 K144R, Oct-3/4 K156R, 및 Oct-3/4 K286R)를 제작하였으며, 이들 변이체 중 Oct-3/4 K156R, 및 Oct-3/4 K286R이 유비퀴틴화가 유의성 있게 억제되는 것을 확인하였다. 또한, Oct-3/4 K156R, 및 Oct-3/4 K286R을 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide)와 함께 처리하였을 때, 야생형(wild type) Oct-3/4에 비해 높은 반감기를 나타냄으로써, 우수한 안정성을 가짐을 밝혀냈다. 따라서, 상기 변이체는 효과적으로 Oct-3/4를 발현시킬 수 있으므로, 역분화 줄기세포 제작 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 높은 반감기를 나타냄으로써 높은 안정성을 가지므로 대량 생산이 가능하다. 본 발명은 Oct-3/4 단백질(서열번호 1의 아미노산)의 변이체를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질에 있어서, 156번의 라이신; 286번의 라이신; 또는 156번 및 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Oct-3/4 단백질 변이체를 제공한다. Oct-3/4 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기 서열은 모두 공지되어 있으며, 예를 들어, Oct-3/4 단백질의 NCBI 억세션 번호(NCBI accession number)는 NP_002692.2 (서열번호 1) 이고, Oct-3/4 단백질을 코딩하는 염기 서열의 NCBI 억세션 번호는 NM_001285986.1 (서열번호 2) 이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질에 있어서 156번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체, 즉 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질에 있어서 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체, 즉 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질에 있어서 156번 및 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체, 즉 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 변이체일 수 있다. 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 156번의 라이신; 286번의 라이신; 또는 156번 및 286번의 라이신을 아르기닌으로 치환함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, 하기 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트를 사용하여, Oct-3/4 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 유전자)를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 156번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체를 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어, 하기 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트를 사용하여, Oct-3/4 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 유전자)를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 변이체를 얻을 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 유비퀴틴화를 통한 단백질 분해기작을 억제할 수 있으므로, 역분화 줄기세포 제작 등에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 높은 반감기를 나타냄으로써 높은 안정성을 가지므로 대량 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 Oct-3/4 단백질 변이체는 효과적인 세포 치료제 및 항암제 개발에 응용될 수 있다. 이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 실시예 (1) 유비퀴틴화 부위의 선별 및 변이체의 제작 하기 9개의 웹사이트(표 1)를 통하여 bioinformatics 분석을 수행하여 Oct-3/4 단백질의 유비퀴틴화 부위 후보군을 분석하였다. 분석 결과, 128번, 144번, 156번, 및 286번 라이신이 가장 많이 반복적으로 나타나는 아미노산 잔기, 즉 효율이 가장 높은 아미노산 잔기로 나타났으며, 이를 유비퀴틴화 부위 후보군으로 하였다. 하기 표 2의 프라이머 세트를 사용하여 Oct-3/4 단백질의 128번, 144번, 156번, 또는 286번 라이신을 각각 아르기닌으로 치환한 Oct-3/4 변이체(즉, Oct-3/4 K128R, Oct-3/4 K144R, Oct-3/4 K156R, 및 Oct-3/4 K286R)를 제작하였다. 구체적으로 야생형 Oct-3/4 유전자(서열번호 2의 유전자)를 주형으로 하고, 각각의 프라이머 세트를 이용하여중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 변성 단계 95℃에서 3분, 결합 단계 56℃에서 1분, 신장 단계 68℃에서 12분으로 총 14 사이클을 수행하였다. 아가로스 겔에서 전기영동을 한 뒤, 젤 닥을 통해 각각의 프라이머에 의해 증폭된 밴드를 확인하였다. 얻어진 변이체, 즉 Oct-3/4 K128R, Oct-3/4 K144R, Oct-3/4 K156R, 및 Oct-3/4 K286R 플라스미드를 지정한 프라이머(ATT TAG GTG ACA CTA TAG)와 미국 Applied Biosystems 사의 3730xl Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, Oct-3/4의 128번, 144번, 156번, 및 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 것을 확인하였다. (2) 웨스턴 블롯팅 분석을 통한 발현 분석 HA-표지된 유비퀴틴화 효소 및 Flag로 각각 표지된 야생형 Oct-3/4 또는 Oct-3/4 변이체(Oct-3/4 K128R, Oct-3/4 K144R, Oct-3/4 K156R, 또는 Oct-3/4 K286R)를 293T 세포에 형질감염(transfection)한 후, 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과는 도 1과 같다(도 1의 상부 패널). 또한, Flag 항체를 사용하여 면역침강법을 수행하였으며, 그 결과는 도 1과 같다(도 1의 하부 패널). 도 1의 결과로부터, Oct-3/4 K156R 및 Oct-3/4 K286R은 유비퀴틴화가 유의성 있게 억제되는 것을 확인할 수 있다. (3) 단백질 합성 억제제 처리에 따른 Oct-3/4 발현 분석 야생형 Oct-3/4, Oct-3/4 K156R 및 Oct-3/4 K286R 각각을 293T 세포에 형질감염(transfection)한 뒤 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드(Cycloheximide)와 함께 처리하였다. 0시간부터 1시간 간격으로 3시간까지의 Oct-3/4 발현량을웨스턴 블롯팅을 통하여 측정하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 또한, 도 2의 결과로부터 0시간부터 3시간까지의 상대적인 Oct-3/4 발현량을 계산한 결과는 도 3과 같다. 도 2 및 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 0시간을 기준으로 1로 보았을 때, 야생형 Oct-3/4는 시클로헥시미드를 처리한 뒤 3시간 때 0.62로 감소하였으나, Oct-3/4 K156R은 0.94, Oct-3/4 K286R은 0.8로 야생형 Oct-3/4에 비해 높은 반감기를 나타내었다. 따라서, Oct-3/4 K156R 및 Oct-3/4 K286R는 반감기가 더 길게 유지되는 것을 확인할 수 있다. The present invention provides an Oct-3/4 protein variant in which lysine at position 156, lysine at position 286, or lysine at positions 156 and 286 in an Oct-3/4 protein is substituted with arginine. The Oct-3/4 protein variant according to the present invention can suppress a protein degradation mechanism through ubiquitination, and exhibits high stability by exhibiting a high half-life compared to wild-type Oct-3/4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질에 있어서, 156번의 라이신; 286번의 라이신; 또는 156번 및 286번의 라이신이 아르기닌으로 치환된 Oct-3/4 단백질 변이체. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질 변이체. 제1항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질 변이체. 제1항에 있어서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 Oct-3/4 단백질 변이체.유비퀴틴화 예측 부위(Ubiquitination Prediction Sites) http://www.ubpred.org http://csb.cse.yzu.edu.tw/UbiSite/ http://bdmpub.biocuckoo.org/prediction.php http://202.195.183.4:8000/mUbiSiDa.php (reprod.njmu.edu.cn/mUbiSiDa) http://www.jci-bioinfo.cn/iUbiq-Lys http://protein.bio.unipd.it/rubi/ http://csb.cse.yzu.edu.tw/UbiNet/ https://omictools.com/ubiquitination-sites-category http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/ 변이체 서열번호 서열 Oct-3/4 K128R 6 정방향 GAG AAG GAG AGG CTG GAG CAA 7 역방향 TTG CTC CAG CCT CTC CTT CTC Oct-3/4 K144R 8 정방향 GCT CTG CAG AGA GAA CTC GAG 9 역방향 CTC GAG TTC TCT CTG CAG AGC Oct-3/4 K156R 10 정방향 CTG AAG CAG AGG AGG ATC ACC 11 역방향 GGT GAT CCT CCT CTG CTT CAG Oct-3/4 K286R 12 정방향 CAG AAG GGC AGG CGA TCA AGC 13 역방향 GCT TGA TCG CCT GCC CTT CTG
