Иммуностимулирующий препарат для сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммуностимулирующих препаратов для профилактики и лечения вирусных и паразитарных заболеваний животных, например парагриппа-3, вирусной диареи, желудочно-кишечных стронгилятозах, стронгилоидозе, трихоцефалезе и других.

Большой научно-практический интерес в настоящее время получили липополисахариды бактериальной клеточной стенки, которые производят поликлональную активацию иммунной системы, способны стимулировать или угнетать ответ на антигены, индуцировать поликлональную иммунную толерантность, что позволило с успехом их использовать для конструирования иммуностимулирующих препаратов.

Известен липополисахарид из штамма бактерий Neisseria meningitidis серогруппы B № 125, обладающий протективными и иммуногенными свойствами, пригодный для создания вакцинных, диагностических и профилактических препаратов.

Известен липополисахарид из штамма бактерий Yersinia pestis, который может быть использован для получения антигенов диагностических и профилактических препаратов, представленный в способе для получения липополисахаридов возбудителя чумы.

Недостатком известных липополисахаридов является то, что они получены из штаммов, которые обладают патогенными свойствами, что при недостаточной обработке бактериальной массы этих штаммов в процессе выделения из них липополисахаридов создает риск заражения сельскохозяйственных животных при парентеральном введении полученного препарата из-за возможности наличия в них остаточного количества живых бактериальных клеток.

Исходя из этого, возникает необходимость использования иммуностимулирующих препаратов, изготовленных на основе липополисахаридов из непатогенных штаммов бактерий.

К таким препаратам относится иммуностимулятор "Продигиозан", который представляет собой высокополимерный липополисахаридный комплекс, выделенный из непатогенного микроорганизма - палочки Bacterium prodigiosum. Обладает наиболее выраженными иммуностимулирующими свойствами: активирует макрофаги, способствует усилению антителообразования и повышению уровня иммуноглобулинов.

Недостатком данного препарата является то, что его введение может сопровождаться повышением температуры тела и обострением воспалительного процесса в очагах воспаления, а также болезненностью и припухлостью в зоне введения, что негативно сказывается на качестве мяса после убоя животного.

Эти недостатки частично устранены в препарате "Альвеозан", полученном на основе липополисахаридов бактериальной массы возбудителя европейского гнильца пчел Bacillus alvei, не имеющего контакта с организмом теплокровных животных, неаллергенного и непатогенного. Препарат стимулирует специфический и неспецифический иммунитет животного [5, 6].

Однако недостатком данного препарата является то, что незначительное превышение рекомендуемых доз в процессе лечения приводит не к стимуляции, а к угнетению иммунитета, что, в свою очередь, будет способствовать усугублению патологического процесса.

В окружающей среде широко распространены непатогенные спорообразующие бактерий Bacillus subtilis, которые могут также быть использованы для получения липополисахаридов с целью дальнейшего конструирования иммуностимулирующих препаратов, однако в информационных источниках отсутствуют данные об использовании липополисахаридов бактерий Bacillus subtilis в качестве активно действующего вещества для конструирования иммуностимулирующих препаратов.

Задачей настоящего изобретения является разработка иммуностимулирующего препарата на основе липополисахаридов, выделенных их спорообразующих бактерий Bacillus subtilis - неаллергенных, безвредных и непатогенных для сельскохозяйственных животных, применение которого не вызывает угнетения иммунитета и усугубления патологического процесса.

Поставленная задача достигается тем, что иммуностимулирующий препарат для сельскохозяйственных животных содержит липополисахарид штамма-продуцента Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 и деионизированную воду при следующем соотношении ингредиентов, мас. %:

Поставленная задача достигается за счет совокупности заявленных признаков и их параметров, а также использования для получения липополисахаридов нового, выделенного на территории Республики Беларусь штамма бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамма-продуцента, неаллергенного, безвредного и непатогенного для сельскохозяйственных животных.

Характеристика штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197.

Таксономическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджи, Bacillus subtilis относится к семейству Bacillaceae, роду Bacillus, виду Bacillus subtilis.

Культурально-морфологические признаки. Подвижные палочки бациллярной формы, окрашиваются по Граму положительно, диаметр клеток 0,7-0,9 мкм, длина варьирует от 1,6 до 3 мкм. Клетки лежат одиночно либо попарно, реже в коротких цепочках по 4-5 штук. Спорообразование активное, эндоспора эллипсовидной формы, расположена в клетке центрально либо субтермально, спорангиум не расширен.

Физиолого-биохимические признаки. Аэробы, растут в температурных границах от 10 до 50 °С. Колонии на мясо-пептонном агаре (МПА) белые, пигмент в среду не выделяют.

Проявляют окислительный тип метаболизма глюкозы. Ферментируют глюкозу, ксилозу, арабинозу, трегалозу, сахарозу, маннит, мальтозу, не сбраживают лактозу, утилизируют цитрат и пропионат, разжижают желатин, восстанавливают нитраты до нитритов. Наблюдается рост в присутствии 5-10 % хлорида натрия.

Патогенные свойства. Штамм бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамм-продуцент - безвреден, не токсичен, авирулентен.

Антагонистическая активность. Штамм Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамм-продуцент - антагонистически активен в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: Staphylococcus, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Pasteurella и Escherichia.

Устойчивость к неблагоприятным факторам. Устойчив к длительному прогреванию, при трипсинолизе антибактериальная активность культуры не снижается.

Условия хранения. Хранят при + 2… + 4 °С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 % полужидком агаре под слоем стерильного вазелинового масла.

Условия и состав сред для размножения штамма. Штамм-продуцент бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 размножают путем посева на жидкие и агаризованные питательные среды (мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, оптимизированная среда Мейнелла).

Состав оптимизированной среды Мейнелла: меласса - 20 г/л; K₂HPO₄ - 7,0 г/л; KH₂PO₄ - 3,0 г/л; MgSO₄ × 7H₂O - 0,1 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 1,0 г/л; Na-цитрат × 3H₂O - 0,5 г/л; H₂O дист. - до 1 л, pH - 7,0.

Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм безвреден, нетоксичен, авирулентен, т.е. не обладает патогенностью, имеет высокую иммуностимулирующую активность за счет входящих в состав его клеточной стенки липополисахаридов, а также выращивается на недорогих питательных средах, таких как мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, оптимизированная среда Мейнелла, включающих стандартные пищевые компоненты, такие как меласса, что позволяет использовать предлагаемый штамм для получения липополисахаридов для конструирования иммуностимулирующих препаратов, обладающих лечебно-профилактическими и лечебными свойствами при вирусных и паразитарных заболеваниях животных, что позволяет нам достичь поставленной задачи.

Пример 1.

Выделение штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197.

Навески образцов почв массой 10 г заливают 30 мл физиологического раствора, затем интенсивно перемешивают в течение 15 мин. Из полученных суспензий с использованием физиологического раствора готовят серию последовательных разведений (10³-10⁶) и по 0,1 мл из каждого разведения высевают на чашки с 2 % МПА методом Коха для определения общего числа микроорганизмов. После прогревания разведений суспензии при 80 °С в течение 10 мин производят высев спор бактерий на плотную агаризованную среду 2 % МПА с целью получения изолированных колоний. Чашки инкубируют при 30 °С в течение 24-48 ч.

Через 24-48 ч на МПА устанавливают образование плоских, слегка блестящих колоний белого цвета с ровными краями.

Пример 2.

Культивирование штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197.

Для получения штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 (посевного материала) используют оптимизированную среду Мейнелла г/л: меласса - 20; K₂HPO₄ - 7,0; KH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄ × 7H₂O - 0,1; (NH₄)₂SO₄ - 1,0; Na-цитрат × 3H₂O - 0,5; H₂O дист. - до 1 л, pH - 7,0, в которой в качестве источников углерода используют дешевый субстрат - мелассу (отход сахаропроизводства). Питательную среду разливают в стерильную посуду и стерилизуют при 0,75 атм 30 мин.

Получение посевной культуры штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 проводят в пробирках со стерильной оптимизированной средой Мейнелла. Культуру штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 вносят из расчета 5 об. %. Засеянные пробирки термостатируют при 37 °С в течение 18 ч. Контроль чистоты посевного материала осуществляют высевом на среды МПА, Эндо, Сабуро.

I генерация штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197. Полученную посевную культуру штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 вносят из пробирок из расчета 5 об. % в стерильные мерные колбы объемом 100 мл и доливают стерильной оптимизированной средой Мейнелла до метки в 100 мл. Засеянные колбы термостатируют при 37 °С в течение 18 ч. Контроль чистоты посевного материала осуществляют высевом на среды МПА, Эндо, Сабуро.

II генерация штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197. Выращенный на предыдущем этапе (I генерация) посевной материал штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 вносят из расчета 5 об. % в стерильные мерные колбы объемом 1000 мл и доливают предварительно проверенной на стерильность оптимизированной средой Мейнелла до объема 1000 мл.

Засеянные колбы термостатируют при 37 °С в течение 18 ч. Контроль чистоты посевного материала осуществляют высевом на среды МПА, Эндо, Сабуро.

Для культивирования штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197, выращенного на предыдущем этапе (II генерация), используют ферментер, который представляет собой вертикальный цилиндрический аппарат с полезным объемом 10-100 дм³, снабженный лопастной мешалкой, рубашкой, соединенный с термостатом для поддержания температуры культивирования и стерильной подачей воздуха. Полученный инокулят культуры штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 вносится в ферментер с соблюдением условий стерильности. Ферментацию штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 проводят в течение 20-24 ч глубинным способом при температуре 35 °С с периодическим перемешиванием при 50 об/мин каждые 3 ч и аэрацией интенсивностью 1,0 л/л среды∙мин на оптимизированной среде Мейнелла.

В конце ферментаций культуральная жидкость штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 должна содержать активно делящиеся типичные микробные клетки в количестве не менее 1×10⁸ КОЕ/мл, не должно содержаться посторонней микрофлоры.

Пример 3.

Определение патогенности, токсичности и токсигенности штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197.

Штамм-продуцент бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 был проверен на соответствие этим критериям с использованием лабораторных тест-объектов - белых мышей и крыс. Исследования по оценке патогенности штамма бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамма-продуцента - на белых мышах и крысах показали, что введение суспензии штамма бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамма-продуцента - в исследованных концентрациях (10⁵-10¹⁰) не вызывает гибели лабораторных животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, а также изменений шерстяного покрова и двигательной активности у лабораторных животных по сравнению с контрольными особями не выявлено.

Фильтрат 3-дневной бульонной культуры штамма бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамма-продуцента, полученный с помощью фильтра Зейтца, после введения его подкожно не вызывал у подопытных животных клинических симптомов интоксикации, гибели, некроза ткани в месте инъекции, что свидетельствует об отсутствии его токсигенности.

При определении токсичных свойств штамма бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - штамма-продуцента - установлено, что после внутрибрюшинного введения прогретой при 80 °С в течение 30 мин культуры бактерий в дозе 10⁷ клеток/мл (смыв со скошенного агара) гибели белых мышей в течение 5 суток наблюдения не отмечено, отсутствовали признаки внешнего изменения тканей в месте инъекции.

В соответствии с полученными данными выделенный штамм-продуцент бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 является непатогенным, нетоксичным и нетоксигенным для лабораторных тест-объектов.

Пример 4.

Получение липополисахаридов штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197.

После культивирования в ферментере штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 в течение 20-24 ч проводят его термогидролиз 1 %-ным раствором гидрооксида натрия при 100 °С в течение 60 мин. После остывания реакционной смеси штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 и 1 %-ного раствора гидрооксида натрия до 20-22 °С отделяют бактериальные клетки штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 от надосадочной жидкости центрифугированием с помощью напольной проточной центрифуги при 8000-10000 об/мин в течение 10 мин, в дальнейшей работе используют надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования. Отделение липополисахарида от надосадочной жидкости проводят путем изменения pH до 1,0-2,0 с помощью 5 %-ного раствора соляной кислоты, в результате чего содержащийся в надосадочной жидкости липополисахарид выпадает в осадок, который отделяют центрифугированием при 8000-10000 об/мин в течение 10 мин.

Пример 5.

Определение оптимальной иммуностимулирующей концентрации липополисахарида штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197.

Оптимальную иммуностимулирующую концентрацию липополисахарида штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 определяли по наиболее выраженной стимуляции лимфоцитов крови в реакции бласттрансформации.

Для постановки реакции бласттрансформации цельную кровь морской свинки разводят в 10-20 раз 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, к разведенной крови приливают раствор митогена в концентрации 0,01 мг/мл. Инкубируют в термостате с содержанием CO₂ - 5 % при 37 °С в течение 4-6 суток. По окончании культивирования эритроциты лизируют 0,83 %-ным раствором хлорида аммония в течение 7-10 мин при комнатной температуре, из расчета 1 мл. раствора хлорида аммония на 300 миллионов эритроцитов.

Для подсчета количества лимфоцитов, трансформировавшихся в бласты, из полученной после лизирования эритроцитов крови изготавливают окрашенные мазки.

Для этого каплю крови при помощи шлифованного стекла размазывают по предметному стеклу и сушат на воздухе в течение 3-5 мин до исчезновения влажного блеска.

Высохшие на воздухе мазки крови опускают пинцетом в стеклянные стаканы с фиксирующей жидкостью - метиловым спиртом - и выдерживают не менее 5 мин. По окончании срока фиксации мазки вынимают пинцетом и сушат на воздухе в течение 3-5 мин. Фиксированные мазки укладывают на мостик, состоящий из двух стеклянных палочек, уложенных на два противоположных края кюветы. Затем мазки заливают разведенной краской. Длительность окрашивания составляет 25-45 мин. После окончания окраски краску смывают (но не сливают) сильной струей воды и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания.

После подсушивания мазков их исследуют под микроскопом: подсчитывают количество клеток, трансформировавшихся в бласты. Подсчет ведут визуально в окрашенных мазках.

Изучение оптимальной иммуностимулирующей концентрации липополисахарида штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 в реакции бласттрансформации проводили в сравнении с аналогами - липополисахаридами Bacterium prodigiosum и Bacillus alvei (табл. 1).

Таблица 1

Оптимальная иммуностимулирующая концентрация липополисахарида (ЛПС) штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197

По данным табл. 1 установлено, что наиболее выраженная стимуляция лимфоцитов наблюдается при использовании липополисахаридов штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 в концентрации 50-200 мкг/мл, при этом увеличение концентрации липополисахаридов не оказывает иммуносупрессивного действия на лимфоциты в сравнении с аналогами, где увеличение концентрации липополисахаридов бактерий Bac. alvei и Bact. prodigiosum с 50 до 100-200 мкг/мл способствует снижению индекса стимуляции лимфоцитов на 0,8-1,4. В то же время при увеличении концентрации липополисахаридов штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 до 100-200 мкг/мл индекс стимуляции лимфоцитов остается на уровне 6,0-6,1, не вызывая иммуносупрессии.

Оптимальной иммуностимулирующей концентрацией липополисахарида (ЛПС) штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 является концентрация 50 мкг/мл.

Деионизированная вода - вода, в которой не содержится ионов примесей. Это, фактически, очень хорошо очищенная вода. Ее удельное сопротивление составляет 18 МОм∙см. Чистота - 99,99999 %.

Пример 6.

Изготовление иммуностимулирующего препарата для сельскохозяйственных животных.

Липополисахарид штамма-продуцента Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 растворяют в деионизированной воде при pH 9,0 при следующих соотношениях ингредиентов, мас. %: липополисахарид штамма-продуцента Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 - 0,0005; деионизированная вода - до 100.

Полученный иммуностимулирующий препарат для сельскохозяйственных животных на основе бактериальных липополисахаридов штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197 стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтровальную установку типа "Миллипор", снабженную мембраной с размером пор 0,2 мкм под давлением 0,1-0,5 атм, что позволяет осуществлять стерилизацию препарата.

Пример 7.

Использование и определение эффективности заявляемого иммуностимулирующего препарата для сельскохозяйственных животных в производственных условиях.

Исследования по изучению эффективности заявляемого иммуностимулирующего препарата для сельскохозяйственных животных в сравнении с существующим аналогом - препаратом "Альвеозан" - проведены на базе СПК "Острошицы" Логойского района Минской области.

В опыт было взято 3 группы животных (2 опытные и 1 контрольная), по 10 голов в группе, возрастом 1,5-2 месяца и живой массой 60-75 кг.

Телятам 1-й опытной группы применили иммуностимулятор в дозе из расчета 10 мкг липополисахарида штамма бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197/кг живой массы один раз в день три дня подряд. Животным 2-й опытной группы - препарат "Альвеозан" в дозе из расчета 10 мкг липополисахарида штамма бактерий Bacillus alvei/кг живой массы один раз в день три дня подряд. Контрольной группе препараты не применяли.

У телят была для исследования взята кровь до обработки и через 4, 8, 18, 29 и 45 дней. Оценку эффективности иммуностимулирующего препарата для сельскохозяйственных животных в сравнении с производственным аналогом проводили по таким показателям, как фагоцитарное число и фагоцитарный индекс (табл. 2).

Таблица 2

Гематологические показатели организма телят после трехкратной обработки

иммуностимулирующим препаратом для сельскохозяйственных животных

Примечание: * - P≤0,05; ** - P≤0,01.

В результате проведенных исследований (табл. 2) установили достоверное (P≤0,05; P≤0,01) увеличение показателей активности макрофагов крови под действием иммуностимулирующего препарата для сельскохозяйственных животных и его известного аналога. Максимальное повышение фагоцитарного числа на 17,66-29,62 % в сравнении с первоначальным уровнем отмечалось через 8 дней после применения препаратов, фагоцитарного индекса на 7,11-7,61 - к 4-му дню наблюдения. При этом фагоцитарное число при использовании иммуностимулирующего препарата для сельскохозяйственных животных в отдельных случаях было выше на 3,53-5, а фагоцитарный индекс - на 4,68-7,9 % в сравнении с производственным аналогом - препаратом "Альвеозан".

Таким образом, заявляемый иммуностимулирующий препарат для сельскохозяйственных животных изготовлен на основе липополисахаридов непатогенного, нетоксичного и нетоксигенного штамма-продуцента бактерий Bacillus subtilis КМИЭВ-В 197, применение которого не вызывает угнетения иммунитета и усугубления патологического процесса, характеризуется высокими иммуностимулирующими свойствами по показателям фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса, которые были выше на 3,53-5 и 4,68-7,9 % в сравнении с производственным аналогом - препаратом "Альвеозан".

Источники информации:

1. Красочко П.А. и др. Методические рекомендации по использованию бактериальных липополисахаридов для стимуляции иммунной системы животных. - Минск, 2013. - С. 4.

2. Патент RU 2074728, МПК⁶, A 61K 35/74, 1997.

3. Патент RU 2483112, МПК⁷, C 12P 19/04, A 61K 39/02, A 61K 39/39, 2013.

4. Красочко П.А. и др. Методические рекомендации по использованию бактериальных липополисахаридов для стимуляции иммунной системы животных. - Минск, 2013. - С. 22-23.

5. Красочко П.А. и др. Методические рекомендации по использованию бактериальных липополисахаридов для стимуляции иммунной системы животных. - Минск, 2013. - С. 26.

6. Красочко П. А. и др. Иммунокоррекция в клинической ветеринарной медицине / Под ред. П.А. Красочко. - Минск: Техноперспектива, 2008. - С. 223-224.

7. Деионизированная вода // Википедия [Электронный ресурс]. - 2014. - Режим доступа: http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/485715 - Дата доступа: 24.11.2014.