Wheat family species Ns genome specific KASP molecular marker primer and application thereof

09-05-2023 дата публикации
Номер:
CN116083626A
Принадлежит: Sichuan Agricultural University
Контакты:
Номер заявки: 60-11-20226714.8
Дата заявки: 13-12-2022

一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用

附图说明

[0024]

图1为本发明中的引物组KP1A-440448839在普通小麦和小麦近缘物种中的分型结果。

[0025]

图2为本发明中的引物组KP4D-349184744在普通小麦和小麦近缘物种中的分型结果。

技术领域

[0001]

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域,具体涉及一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用。

具体实施方式

[0026]

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

[0027]

本发明中用到的实验材料如下所示:

[0028]

普通小麦中国春(CS,TriticumaestivumL.,AABBDD,2n=6x=42)、普通小麦中国春ph2b突变体(CSph2b,AABBDD,TriticumaestivumL.,2n=6x=42)、华山新麦草ZY3157(Psathyrostachyshuashanica,NsNs,2n=2x=14)、新麦草PI314082(Psathyrostachysjuncea,NsNs,2n=2x=14)、二倍体长穗偃麦草PI531750(Thinopyrumelongatum,EeEe,2n=2x=14)、簇毛麦PI47027(Dasypyrumvillosum,VV,2n=2x=14)、大麦Y1819(Hordeum,HH,2n=2x=14)、冰草PI499389(Agropyroncristatum,PP,2n=2x=14)、黑麦QL(Secalecereale,RR,2n=2x=14)、拟鹅观草PI228391(Pseudoroegneria libanotica,StSt,2n=2x=14)、多枝赖草PI440325(Leymusmulticaulis,NsNsXmXm,2n=4x=28)、大赖草ZY07023(Leymusracemosus,NsNsXmXm,2n=4x=28)、沙生赖草PI294582(Leymusarenarius,NsNsNsNsXmXmXmXm,2n=8x=56)。

[0029]

实验例1SNP位点的获得

[0030]

取适量华山新麦草ZY3157叶和根的幼嫩组织送往北京贝瑞和康生物技术有限公司测序。利用Hisat2将华山新麦草reads比对至中国春参考基因组(iwgsc_refseqv1.0);通过Samtools和Picard-tools工具对比对结果进行排序、去重;通过Gatk进行SNP挖掘,过滤质量低于30、覆盖度小于等于4的SNP位点,最终获得790759个高质量SNP位点,并利用软件Annovar对所有的SNP进行注释,获得SNP在中国春基因组的位置信息。

[0031]

实验例2KASP分子标记引物的开发

[0032]

根据SNP注释信息,随机选择一部分位于外显子区域且上游30bp、下游100bp无其他SNP变异的SNP位点,提取SNP位点上游30bp下游100bp序列,利用在线引物设计平台PolyMarker(https://www.polymarker.info)对所选的SNP位点进行KASP分子标记引物设计。最终选择的分子标记引物序列为在中国春同一基因内且不跨越内含子区域的引物,共43对,所有引物均由成都擎科伟业生物技术有限公司合成。

[0033]

实验例3KASP分型验证

[0034]

利用实验例2中开发的KASP分子标记引物,在普通小麦亲本CS、CSph2b,华山新麦草、新麦草、大赖草、多枝赖草、沙生赖草、二倍体长穗偃麦草、冰草、簇毛麦、大麦、黑麦、拟鹅观草中进行KASP基因分型验证。根据验证结果,得到2个Ns基因组特异KASP分子标记引物,包含引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744,具体序列如下所示。引物组KP1A-440448839对应中国春1A染色体第440448839个碱基由T突变为C(华山新麦草),引物组KP4D-349184744对应中国春4D染色体第349184744个碱基由G突变为C(华山新麦草)。其中,引物组KP1A-440448839的KASP分型结果如图1所示,引物组KP4D-349184744的KASP分型结果如图2所示。

[0035]

其中,两个引物组的KASP分子标记引物序列如下(5’→3’):

[0036]

引物组KP1A-440448839包含:

[0037]

F-FAM(SEQ ID NO.1):

[0038]

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCACCTGCTTAGCTTTGGCT

[0039]

F-HEX(SEQ ID NO.2):

[0040]

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACCTGCTTAGCTTTGGCC

[0041]

R(SEQ ID NO.3):

[0042]

CAGGCTGTGGAAGGGCTA

[0043]

引物组KP4D-349184744包含:

[0044]

F-FAM(SEQ ID NO.4):

[0045]

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATAACCTCCAGATGATTGCG

[0046]

F-HEX(SEQ ID NO.5):

[0047]

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGATAACCTCCAGATGATTGCC

[0048]

R(SEQ ID NO.6):

[0049]

GGCATCCCAGTAGCAACATAT。

[0050]

其中,KASP基因分型时的PCR扩增具体条件包括如下:

[0051]

PCR反应体系(10μL):DNA模板(200ng/μL)1μL,混合引物1.4μL(10μM),2×KaspMasterMix5μL,ddH2O2.6μL。混合引物体系(100μL):两个引物组的F-FAM和F-HEX引物(上游引物)各12μL,R引物(下游引物)30μL,H2O46μL。

[0052]

PCR反应程序为:程序分为4个阶段,第一阶段:95℃10min;第二阶段:95℃20s,61℃45s,10个循环,每个循环降低0.6℃;第三阶段:95℃20s,55℃45s,32个循环;第四阶段:25℃1min。第五阶段:95℃20s,55℃40s,3个循环;30℃30s。基因分析由Bio-RadCFXManger完成。

[0053]

根据检测,两个分子标记引物组在二倍体长穗偃麦草、冰草、簇毛麦、大麦、黑麦、拟鹅观草中扩增信号表现为橙色(Allele1)荧光信号,在华山新麦草、新麦草中表现为蓝色(Allele2)荧光信号,在大赖草、多枝赖草中表现为绿色(Heterozygote)荧光信号,表明该KASP分子标记引物是Ns基因组特异的。本发明提供的KASP分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测,也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段鉴定,且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组,具体包括以下任意一种或几种:①检测华山新麦草Ns染色体;②检测含有华山新麦草Ns染色体的产品;③追踪华山新麦草Ns染色体;④追踪含有华山新麦草Ns染色体的产品;⑤分子标记辅助选择育种;⑥制备分子标记辅助选择育种的产品;⑦小麦分子育种;⑧制备小麦分子育种的产品。这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了基础。

[0054]

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

背景技术

[0002]

小麦(TriticumaestivumL.)是世界上种植面积最大、总产量仅次于玉米的粮食作物(葛江燕,2012),为全球约40%的人口提供了能量来源(Lietal.2019)。但是近年来随着耕作制度的变化及育种中少数亲本的反复使用,导致小麦的遗传多样性降低,对生物胁迫和非生物胁迫抗性降低,制约了小麦产量和品质的提高,难以育成突破性品种(Jiangetal.1993;何中虎等,2011)。小麦近缘物种中蕴藏着丰富的优良基因,通过远缘杂交的方式将其优良基因导入到普通小麦,可以丰富小麦的遗传多样性(刘成等,2020)。

[0003]

小麦族物种包含多种重要种属,涉及多种基因组组成。新麦草属是小麦族中非常重要的Ns基因组供体属,赖草属则为异源多倍体的大属,含有来自新麦草属物种的Ns基因组(颜济,杨俊良,2011)。我国现有4种新麦草属物种,包括华山新麦草(Psathyrostachyshuashanica)、毛穗新麦草(Psathyrostachyslanuginose)、单花新麦草(Psathyrostachyskronenburgii)和新麦草(Psathyrostachysjuncea),现有研究主要集中于华山新麦草和新麦草(盛誉,2020)。华山新麦草因其具有抗病(条锈病、秆锈病、白粉病、全蚀病)、抗逆(耐寒、耐旱、耐盐碱)、早熟、矮秆、多分蘖等优良特性已被广泛应用于小麦遗传改良(Baden1991,黄娟等,2019)。新麦草分蘖多、叶量大、抗性好、早春且反青和再生性能好,其资源利用研究主要集中与牧草和小麦改良(范亚坤等,2020;陈勤等,1988)。赖草属包含60多种,广泛分布与全球各地。该属植物多数物种为草原和草甸的主要组成成分;许多种类因具有较高的饲用价值已作为优良牧草利用(张立,2015)。同时,因赖草属植物常生长在盐碱地和干旱地区,对寒冷、干旱、盐碱土等环境具有高度适应性,部分物种还具有抗病虫、穗大、粒多、高光效、高氮素利用率等优良特性(葛荣朝等,2001;Subbaraoetal.2021)。目前,大赖草(Leymus racemosus)、多枝赖草(Leymusmulticaulis)和滨麦PI567896(Leymusmollis)已经和小麦成功杂交并获得了部分农艺性状优异的附加系、代换系和渗入系等异染色体系(Liuetal.2002;Zhaoetal.2013;Subbaraoetal.2021;Yangetal.2020;Lietal.2021;Jinetal.2021)。

[0004]

在种质资源利用过程中,分子标记已被广泛用于外源染色体或染色体片段的检测与跟踪,加速种质创新(Fedaketal.1999)。目前,Ns基因组物种特异分子标记主要有华山新麦草RAPD(RandomAmplifiedPolymorphic DNA)标记、SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegions)标记和普通PCR(PolymeraseChainReaction)标记;新麦草特异RAPD标记;大赖草特异RAPD标记、SNP(Singlenucleotidepolymorphism)标记和普通PCR标记以及滨麦EST-SSR(ExpressedSequenceTag-SimpleSequenceRepeat)标记、STS(Sequence-taggedsite)标记、普通PCR标记和SNP标记(陈林刚等,2010;Duetal.2013;Tanetal.2022;Edetetal.2018a;2018b)。目前,转录组测序技术已广泛应用于SNP挖掘并开发KASP标记引物(Wangetal.2017;Zhouetal.2017;Okadaetal.2018),而利用转录组测序技术获得SNP变异并开发小麦族物种中Ns基因组特异KASP标记引物还未见报道,这严重阻碍小麦族物种中Ns基因组物种优异基因资源的开发与利用。

发明内容

[0005]

本发明的目的是提供一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用,该分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测,也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段的鉴定,且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组,为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了重要途径。

[0006]

为了达到上述目的,本发明提供了一种华山新麦草Ns染色体特异KASP分子标记引物,该分子标记引物包含两个引物组,分别为引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744,这两个引物组分别包含F-FAM、F-HEX、R三条引物,其中,引物组KP1A-440448839包含的引物,其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示;引物组KP4D-349184744包含的引物,其核苷酸序列依次分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

[0007]

本发明还提供了一种华山新麦草Ns染色体的基因分型方法,该方法通过采用上述的两个引物组对待测株系的基因组DNA进行PCR扩增。

[0008]

优选地,上述基因分型方法中的PCR扩增条件如下:

[0009]

PCR反应体系为10μL:200ng/μL的DNA模板1μL,10μM的混合引物1.4μL,2×KaspMasterMix5μL,ddH2O2.6μL。

[0010]

PCR反应程序为:95℃10min;95℃20s,61℃45s,10个循环,每个循环降低0.6℃;95℃20s,55℃45s,32个循环;25℃1min;95℃20s,55℃40s,3个循环;30℃30s。

[0011]

其中,上述混合引物的体系为100μL:包含F-FAM和F-HEX引物各12μL,R引物30μL,H2O46μL。

[0012]

本发明还提供了一种用于鉴定华山新麦草Ns染色体的试剂盒,该试剂盒包含上述的引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744。

[0013]

本发明提供的KASP分子标记引物可被用于以下任意一种:

[0014]

①检测华山新麦草Ns染色体;

[0015]

②检测含有华山新麦草Ns染色体的产品;

[0016]

③追踪华山新麦草Ns染色体;

[0017]

④追踪含有华山新麦草Ns染色体的产品;

[0018]

⑤分子标记辅助选择育种;

[0019]

⑥制备分子标记辅助选择育种的产品;

[0020]

⑦小麦分子育种;或

[0021]

⑧制备小麦分子育种的产品。

[0022]

本发明的小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物,解决了小麦族物种Ns基因组的鉴定问题,具有以下优点:

[0023]

本发明利用RNA测序技术对华山新麦草进行测序,通过序列比对分析,挖掘了华山新麦草与小麦中国春间的SNP变异,基于SNP位点信息和普通小麦中国春参考基因组信息,设计引物并在普通小麦、华山新麦草和10种小麦族物种中验证,获得小麦族物种Ns基因组特异的KASP分子标记引物。本发明开发的KASP分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测,也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段鉴定,且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组,这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了重要途径。



The invention discloses a wheat species Ns genome specific KASP molecular marker primer and application thereof, and relates to the technical field of molecular marker assisted breeding, the molecular marker primer comprises two primer groups, namely a primer group KP1A-440448839 with a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.1-3 and a primer group KP4D-349184744 with a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.4-6. The molecular marker primer comprises a primer group KP1A-440448839 with a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.3 and a primer group KP4D-349184744 with a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.4. The KASP molecular marker primer provided by the invention not only can be used for rapid detection of the Ns genome in a common wheat background, but also can be used for identification of chromosomes or chromosome segments of all species containing the Ns genome in a wheat family, and can be used for accurately identifying and distinguishing Ns and genomes of other wheat related species; a foundation is provided for wheat family systematic evolution, germplasm resource identification and molecular marker-assisted selective breeding.



0001.

1.一种华山新麦草Ns染色体特异KASP分子标记引物,其特征在于,该分子标记引物包含两个引物组,分别为引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744,所述的两个引物组分别包含F-FAM、F-HEX、R三条引物,所述引物组KP1A-440448839包含的引物,其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示;所述引物组KP4D-349184744包含的引物,其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

0002.

2.一种华山新麦草Ns染色体的基因分型方法,其特征在于,该方法采用如权利要求1所述的KASP分子标记引物对待测株系的基因组DNA进行PCR扩增。

0003.

3.根据权利要求2所述的基因分型方法,其特征在于,所述的PCR扩增条件如下:

PCR反应体系为10μL:200ng/μL的DNA模板1μL,10μM的混合引物1.4μL,2×KaspMasterMix 5μL,ddH2O 2.6μL;

PCR反应程序为:95℃10min;95℃20s,61℃45s,10个循环,每个循环降低0.6℃;95℃20s,55℃45s,32个循环;25℃1min;95℃20s,55℃40s,3个循环;30℃30s。

其中,所述混合引物的体系为100μL:包含F-FAM和F-HEX引物各12μL,R引物30μL,H2O 46μL。

0004.

4.一种用于鉴定华山新麦草Ns染色体的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含如权利要求1所述的KASP分子标记引物。

0005.

5.如权利要求1所述的KASP分子标记引物在以下任意一种中的应用:

①检测华山新麦草Ns染色体;

②检测含有华山新麦草Ns染色体的产品;

③追踪华山新麦草Ns染色体;

④追踪含有华山新麦草Ns染色体的产品;

⑤分子标记辅助选择育种;

⑥制备分子标记辅助选择育种的产品;

⑦小麦分子育种;或

⑧制备小麦分子育种的产品。