SNP (Single Nucleotide Polymorphism) molecular marker related to brassica napus dwarf character and application of SNP molecular marker

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A03号染色体的第17985410bp碱基处，多态性为A或G；或者位为SEQ ID NO.1所示序列的第61碱基处，多态性为A或G，所述SNP分子标记核苷酸序列为：GAGAGAGGGAGAAAGAAGAGAGAGCATGGGGTGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAA GGC[A]GCATGTATAAATGGAAAGAGTGAACAACAATGGATGACCAAAGAGAGATTTTAT TTACAA(SEQ ID NO.1)；或GAGAGAGGGAGAAAGAAGAGAGAGCATGGGGTGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAA GGC[G]GCATGTATAAATGGAAAGAGTGAACAACAATGGATGACCAAAGAGAGATTTTAT TTACAA(SEQ ID NO.2)。

一种基于矮秆基因BnaA03g36950位点的KASP分子标记引物，包含分子标记KASP分子标记引物，该KASP分子标记引物包括：正向引物1、正向引物2和第一通用反向引物，具体是：

正向引物1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCG-3’，如SEQ ID NO:1；

正向引物2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCA-3’，如SEQ ID NO:4；

第一通用反向引物：

5’-ATCCATTGTTGTTCACTCTTTCCATT-3’，如SEQ ID NO:5；

上述KASP分子标记引物的获取方式如下：

一、差异与矮秆性状共分离的差异SNP获得，具体是：

1、分离群体构建：以纯合的甘蓝型矮秆油菜品种FL1号为父本，以待转育油菜品系20B为母本，进行杂交获得F1，进一步将F1与20B回交获得BC₁F₁群体。

2、DNA提取，详情如下：①取约2段1.5cm长叶片或种子至1.3mL的96孔板中，将96孔板置于-80℃冰箱4小时或以上；②将1.3mL96孔板至于烘箱中，65℃烘干10小时或以上，烘干结束后，取出1.3mL96孔板，向1.3mL 96孔板每孔中加入2颗4mm钢珠；③迅速封上硅胶膜，置于genogrinder 2010中，转速调至1500rpm并研磨1分钟，效果不好时可适当延长研磨时间，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；④取出96孔板，小心撕开硅胶板，每孔加含Tris-HCl的提取液500uL，随后盖上新的硅胶板并将1.3mL96孔板置于漩涡振荡器上适当振荡；⑤将96孔板置于调温至75℃的烘箱中温浴约40分钟；⑥温浴结束后取出96孔板，将其于深孔板冷冻离心机中，转速调至4000rpm温度调至室温，离心10分钟；⑦离心结束后，取出96孔板，抽取上清液190uL至另一块预加190uL异丙醇的0.8mL 96孔板，并封上硅胶膜，于漩涡振荡器上振荡数次，后将其置于-20℃冰箱沉淀1小时或以上；⑧取出96孔板置于深孔板冷冻离心机中，转速调至4000rpm温度调至4℃并离心10分钟；⑨去掉上清液并将96孔板置于65℃烘箱中30分钟将其烘干；⑩取出96孔板，每孔加500uL超纯水，盖上硅胶盖，于漩涡振荡器上振荡数次，后置于室温下过夜，隔夜即可使用。

3、纯合的甘蓝型油菜矮秆位点的差异SNP标记的获取，具体是：

以20B、ZS11等高秆甘蓝型油菜为对照，通过50K油菜专用型芯片与矮秆材料FL1进行分析比对：将样本在37℃进行扩增，DNA片段化与纯化，95℃变性，48℃杂交，单碱基延伸，扫描并获取基因型。HiScan扫描获取图片后，使用GenomeStudio软件(Illumina Inc.,SanDiego,CA,USA)获取基因型数据并进一步分析。

得到基因型数据后，利用Excel(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)的IF函数进行多态性SNP筛选。筛选的标准为：(1)在2个常规高秆甘蓝型油菜中基因型一致；(2)矮秆FL1与高秆20B之间存在多态性差异；(3)以与矮秆基因位点BnaA03g36950位置为标准，筛选位于该位点上下游120Kb左右的SNP。根据以上标准，筛选到8个有差异SNP，详见表1：

表1 8个差异SNP标记统计表

二、KASP分子标记开发

选取SNP所示，为：SNP：Bn-A03-p17985410，位于染色体chrA03上16992552位置处，[G/A]，BN900084。

以上进行KASP分子标记开发，得到特异性引物，然后在特异性引物5’端分别加上FAM和HEX荧光接头序列，选择PAGE或者iPAGE的纯化方式，最终获得KASP分子标记引物A和KASP分子标记引物B。

本实施例在KASP标记开发过程中，利用17份FL1、10份20B和4份ZS11，以及FL1与20B进行杂交的F2后代，验证标记Assay分型情况，具体是：

按照表2说明进行KASP反应检测使用：

表2KASP反应检测条件

Touchdown PCR反应条件为：

①94℃，15m；②95℃，20s；③65℃-56℃，60s；(第②和第③两个步骤进行10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃)④94℃，20s；⑤57℃，60s。(第④和第⑤两个步骤进行30个循环)。

三、分离群体大田种植与株高鉴定

应用本实施例的KASP分子标记引物进行大田验证，具体操作如下：

将亲本材料FL1、20B及其构建的F2代分离群体种植于湖南省农业科学院作物研究所马坡岭试验田内，苗期取新鲜叶片对KASP标记BN900084进行验证(详见图1)，以结荚后大田株高测量结果作为对照，检测的94个样品，纯合G:G位点的17个单株平均株高102cm，纯合A:A位点单株株高171.3cm，杂合G:A位点的平均株高134.5cm，无检测值3株。亲本FL1平均株高100.4cm，20B平均株高180.5cm，检测结果与株高一一对应。

表3BN900084及对照亲本的检测结果

实施例2：

采用如实施例1中所述的KASP分子标记KASP分子标记引物(BN900084.K01)，对亲本材料FL1、20B及其以20B为回交亲本构建的回交1代分离群体在青海省农科院试验大田进行验证。共检测了120个单株且在成熟期测量株高，并进行一一比对，其中获得纯合A：A位点单株67株，平均株高139.0cm，杂合G：A位点45株，平均株高96.6cm，无检测值2株。当地亲本FL1株高79.5cm，20B株高145cm，检测结果与株高性状一一对应。

表4BN900084的检测结果与成熟期株高性状

实施例3：

采用如实施例1、实施例2中所述KASP分子标记引物在矮秆观赏型甘蓝型油菜育种改良中的应用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。