Method for reducing lactic acid fermentation byproduct succinic acid
技术领域 本发明属于生物技术领域，主要涉及一种乳酸发酵生产的方法 具体实施方式 为了进一步说明本发明技术方案的有益效果，下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。 本发明实施例主要原料信息： 乙醇酸甲酯购自alfa，货号A17870； 丙二酸二甲酯购自CATO，货号CCFD200172； 羟基丙二酸二乙酯购自Sigma-Aldrich，货号86320； 3-硝基丙酸购自Sigma-Aldrich，货号N5636； 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)购自Sigma-Aldrich，货号D8310； 氯化汞购自沪试，货号10013616； 大肠杆菌重组菌购自中国普通微生物保存中心，菌种编号CGMCC 11059。 LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用1M氢氧化钠溶液调pH至7.4，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min； M9培养基：先配置1M的MgSO4，MgSO4·7H2O 2.46g加去离子水10ml溶解，高压灭菌备用；配置1M的CaCl2，CaCl2·6H2O 2.191g加去离子水10ml溶解，高压灭菌备用；再配置5×M9盐溶液，Na2PO4·7H2O 12.8g、KH2PO4 3.0g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1.0g，加去离子水200ml溶解，121℃灭菌15min；配置20％葡萄糖溶液，4g葡萄糖加去离子水16ml溶解，0.22μm滤器过滤除菌；无菌室将5×M9盐溶液200ml、1M MgSO4 2ml、20％葡萄糖溶液20ml、1M CaCl2 0.1ml加灭菌去离子水至1L。 酵母粉、蛋白胨购自oxoid，其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。 1.摇瓶种子培养 在250mL三角瓶中装50mL LB培养基，接种大肠杆菌重组菌(CGMCC 11059)甘油管，37℃、250r/min摇床培养11h。 2.种子罐培养试验 摇瓶种子按照初始5％接种量接种于1.5L M9液体培养基：先配置1M MgSO4的发酵罐中，接种后发酵罐初始体积为工作体积的25％-60％，温度控制37℃，维持pH6.8-7.5，溶氧控制20％，通气量为0.1vvm-2.0vvm，转速为200-1000r/min；当菌体浓度达到OD600为20，作为种子液接种于发酵罐。 3.发酵罐发酵试验 将种子液按照5％的接种量接种于含有M9液体培养基的发酵罐中，接种后发酵罐初始体积为工作体积的25％-60％，发酵按照两阶段发酵法进行(田康明等，生物工程学报,29:111-114,2013)。发酵中的菌体生长阶段，温度控制37℃，维持pH 6.8-7.5，通气量为0.1-2.0vvm，转速为200-1000r/min，控制溶氧20％；当菌体浓度达到OD600为30，进入乳酸发酵阶段，温度控制42℃，搅拌转速调为200r/min，流加25wt％氢氧化钙悬浊液维持pH在6.0-7.5。发酵产酸阶段的葡萄糖采用连续流加或分批补料的方式，其中，分批补料方法中，分四次补加终浓度6wt％的葡萄糖液，总补加量为起始发酵体积的25％；流加补料方法中，通过糖液流加速度的控制，维持糖浓度，糖液总量为起始发酵体积的25％。 4.发酵过程分析 样本制备：取1mL需检测的发酵液与50μL的50％浓硫酸混匀后8000r/min离心10min，吸取适量的上清液，加乙腈定容至5ml，混匀后10000r/min离心5min，上清液用5mM硫酸稀释后经0.22μm有机系微孔滤膜过滤，进行相关组分的分析测定。 (1)葡萄糖浓度测定：将样品使用去离子水稀释后使用SBA-40C型生物传感仪进行葡萄糖浓度的测定，取三次平行数据的平均值。 (2)OD检测，菌体生长阶段发酵液使用去离子水稀释，OD600检测，乳酸发酵阶段发酵液使用1M盐酸稀释，OD600检测。 (3)D-乳酸、L-乳酸和丁二酸含量测定：采用HPLC进行，色谱检测条件为：色谱柱为HPX-87H有机酸分析柱，柱温为65℃，检测波长为210nm，流动相为5mM浓度的硫酸溶液，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。所有数据均为3次平行试验结果的平均值。 抑制率＝(N1-N2)/N1*100％ 其中N1：对照组丁二酸含量，N2：检测丁二酸含量 实施例1 乙醇酸甲酯对乳酸发酵的影响 将乳酸生产菌种的摇瓶种子液，接种于1.5L M9液体培养基中，37℃、200-1000r/min培养7h后，取培养液按照起始OD值0.3的接种量接种于葡萄糖浓度为30g/L的M9液体培养基中，接种后50L发酵罐初始体积为25L，温度控制为37℃、通气量为0.5-2.0vvm、搅拌转速为200-1000r/min，控制溶氧20％，用氨水维持pH 6.5-7.0；当菌体浓度达到OD600为30，加入终浓度0-10mM乙醇酸甲酯，关闭通风、搅拌转速为200r/min、发酵温度控制为42℃，将总量葡萄糖(以发酵起始体积计，葡萄糖的添加总量约为240g/L)分4次补加入发酵罐，流加25wt.％氢氧化钙悬浊液维持pH在7.0，发酵结束前残糖浓度低于0.2g/L后结束发酵。 在此发酵条件下，流加葡萄糖总量保持一致，取发酵液检测乳酸和丁二酸含量。 表1乙醇酸甲酯对乳酸发酵的影响
实施例2 丙二酸二甲酯对乳酸发酵的影响 乳酸发酵过程同实施例1，当菌体浓度达到OD600为25时，加入终浓度0-20mM丙二酸二甲酯。 表2丙二酸甲酯对乳酸发酵的影响
实施例3 羟基丙二酸二乙酯对乳酸发酵的影响 乳酸发酵过程同实施例1，当菌体浓度达到OD600为20时，加入终浓度0-1mM丙二酸二甲酯。 表3羟基丙二酸二乙酯对乳酸发酵的影响
实施例4 3-硝基丙酸对乳酸发酵的影响 乳酸发酵过程同实施例1，当菌体浓度达到OD600为30时，加入终浓度0-0.1mM 3-硝基丙酸。 表4 3-硝基丙酸对乳酸发酵的影响 实施例5 氯化汞对乳酸发酵的影响 乳酸发酵过程同实施例1，当菌体浓度达到OD600为25时，加入终浓度0-0.1mM氯化汞。 表5氯化汞对乳酸发酵的影响
实施例6 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)对乳酸发酵的影响 乳酸发酵过程同实施例1，当菌体浓度达到OD600为30时，加入终浓度0-0.1mM 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)。 表6 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)对乳酸发酵的影响
实施例7 组合C对乳酸发酵的影响 乳酸发酵过程同实施例1，当菌体浓度达到OD600为30时，加入终浓度0-0.05mM组合C，C为3-硝基丙酸乙酯、氯化汞和5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)混合物，组成比例为5:3:2。 表7组合C对乳酸发酵的影响
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。 背景技术 当前，石油基化学品作为原材料广泛的应用在聚合材料、纺织品、油漆和有机溶剂等领域。然而在全球气候变暖和石油资源日趋紧缺的大背景下，聚乳酸作为生物可降解材料的典型代表被认为是石油基塑料等材料的主要替代品之一。利用大宗廉价原料，制备聚乳酸加工中需求的极高光学纯度和极高化学纯度的D-乳酸和L-乳酸，是聚乳酸产业发展的必需，也是有机酸工业发展与变革的新动力。 为获得高底物转化率、高产率、目标产物的高光学和高化学纯度的乳酸发酵为目标，对代谢途径进行改造，以基因工程菌株作为乳酸生产菌。 琥珀酸的主要合成途径有三个，其一是在富马酸还原酶的作用下富马酸被还原形成琥珀酸；其二是在琥珀酰辅酶A合成酶的作用下琥珀酰辅酶A水解形成琥珀酸。其三是异柠檬酸参与半醛酸循环过程中形成琥珀酸(aceA)。在好氧代谢下，琥珀酸的形成过程和分解过程同时进行，大肠杆菌几乎不积累琥珀酸。在厌氧代谢下，大肠杆菌则在富马酸还原酶的作用下积累琥珀酸。乳酸的合成过程往往是厌氧或低供氧培养条件，因此，通过途径改造阻断琥珀酸的合成过程是必要的。CN 104278003 B，以大肠杆菌为出发菌株，敲除富马酸还原酶基因frdABCD，阻断丁二酸厌氧生成途径。CN 105705630 A通过敲除富马酸还原酶基因frdA，阻断丁二酸厌氧生成途径。 但实际情况是，一方面，基因改造成本较高，操作复杂，另一方面，虽然丁二酸厌氧途径被阻断，但是发酵罐中仍存在部分空气，或者在培养前期好氧增殖阶段发酵液中也存在氧气，虽然停止通风进行厌氧培养，上述条件下存在的氧气仍会进入细胞中，通过好氧途径生成丁二酸，并造成丁二酸的积累。若是通过基因工程手段阻断丁二酸好氧生成途径，将会导致细菌无法生长。而丁二酸的生成不但会导致乳酸转化率降低，在分离和纯化乳酸的过程中也会导致收率的降低，最终增加高化学纯度乳酸成本。 发明内容 本发明针对乳酸发酵过程中无法完全抑制丁二酸生成的问题，通过在发酵过程中使用异柠檬酸裂解酶(aceA)特异性抑制剂，阻断丁二酸产生。 为了实现上述效果，本发明提供一种降低乳酸发酵副产物丁二酸的方法，其包含如下步骤： (1)培养乳酸生产菌种子液，将生产菌种子液接种于含培养基的发酵罐进行菌体生长；(2)当菌体浓度达到OD600为10-50，加入异柠檬酸裂解酶特异性抑制剂，之后进入产酸阶段进行乳酸发酵；所述特异性抑制剂为乙醇酸甲酯、丙二酸二甲酯、羟基丙二酸二乙酯、3-硝基丙酸乙酯、氯化汞或5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)中的一种或其组合物。 优选的，所述抑制剂的组合为乙醇酸甲酯、丙二酸二甲酯和氯化汞的混合物；或为乙醇酸甲酯、丙二酸二甲酯、羟基丙二酸二乙酯和3-硝基丙酸乙酯的混合物；更优选的组合为3-硝基丙酸乙酯、氯化汞和5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)混合物。 步骤(1)中所述乳酸生产菌种选自大肠杆菌重组菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳酸杆菌、黑曲霉和酵母菌中的一种或多种。 步骤(1)中所述种子液为摇瓶培养种子液和/或种子罐培养种子液，所述摇瓶培养种子液的培养基为LB培养基，摇瓶培养条件：在三角瓶中装LB培养基，接种乳酸生产菌种甘油管，30-37℃、100-500r/min摇床培养10-14h。 所述种子罐培养种子液的培养条件：摇瓶种子按照初始3-5％接种量接种于液体培养基的种子罐中，接种后种子罐初始体积为工作体积的25％-60％，温度控制30-37℃，通过流加碱性中和剂维持pH6.8-7.5，控制溶氧20-60％，通气量为0.1vvm-2.0vvm，转速为200-1000r/min；当菌体浓度达到OD600为10-30，作为种子液接种于发酵罐。 所述液体培养基为M9培养基，所述种子罐工作体积为40-60％，优选50-60％。 所述种子罐溶氧控制20-60％，优选20-40％，更优选20-30％； 所述碱性中和剂选自氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化镁、氨水中的一种或多种，优选氨水。 所述通气气体为无菌空气。 所述步骤(1)菌体生长阶段温度控制为37-45℃，pH 6.8-7.5，通气量为0.1-2.0vvm，转速为200-1000r/min，溶氧为10-30％； 步骤(2)中所述乳酸发酵的工艺还包含流加碱性中和剂维持pH在6.0-7.5的工艺。 所述碱性中和剂为氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化镁、氨水中的一种或多种，优选氢氧化钙。 步骤(2)中所述发酵产酸阶段还包含连续流加或分批补料葡萄糖的工艺。 步骤(2)中所述产酸阶段培养条件为温度控制37-50℃，优选为37-45℃，更优选为40-45℃，转速控制100-500rpm，更优选为100-300rpm。 步骤(2)中所述OD600为15-45时，更优选为20-30时加入丁二酸特异性抑制剂。 所述步骤(2)中特异性抑制剂浓度为0.01-20mM，优选为0.03-15mM。 优选的，所述多种抑制剂的组合为3-硝基丙酸乙酯、氯化汞和5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)混合物，作用浓度为0.01-0.05mM，优选为0.03-0.05mM,混合物组成比优选为(5-7):(2-3):(1-2)。 本发明的有益效果如下： 相比目前的乳酸生产工艺，本发明在乳酸发酵过程中加入异柠檬酸裂解酶特异性抑制剂，既不影响乳酸的生产，又可以有效降低丁二酸的合成，抑制率最高可达到60-100％。 The invention relates to a method for blocking generation of a fermentation byproduct succinic acid by adding an isocitrate lyase specific inhibitor in a lactic acid fermentation process. The specific inhibitor comprises one or a composition of more of methyl glycolate, dimethyl malonate, diethyl hydroxymalonate, ethyl 3-nitropropionate, mercuric chloride or 5, 5 '-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), and can effectively reduce the content of succinic acid in lactic acid. 1.一种降低乳酸发酵副产物丁二酸的方法，其包含如下步骤： (1)培养乳酸生产菌种子液，将生产菌种子液接种于含培养基的发酵罐进行菌体生长；(2)当菌体浓度达到OD600为10-50，加入异柠檬酸裂解酶特异性抑制剂，之后进入产酸阶段进行乳酸发酵；所述特异性抑制剂为乙醇酸甲酯、丙二酸二甲酯、羟基丙二酸二乙酯、3-硝基丙酸乙酯、氯化汞或5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)中的一种或其组合物。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制剂的组合为乙醇酸甲酯、丙二酸二甲酯和氯化汞的混合物；或为乙醇酸甲酯、丙二酸二甲酯、羟基丙二酸二乙酯和3-硝基丙酸乙酯的混合物；更优选的组合为3-硝基丙酸乙酯、氯化汞和5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)混合物。 3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中特异性抑制剂浓度为0.01-20mM，优选为0.03-15mM。 4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种抑制剂3-硝基丙酸乙酯、氯化汞和5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)混合物组成比为(5-7):(2-3):(1-2)，浓度为0.01-0.05mM，优选为0.03-0.05mM。 5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述乳酸生产菌种选自大肠杆菌重组菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳酸杆菌、黑曲霉和酵母菌中的一种或多种。 6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)菌体生长阶段温度控制为37-45℃，pH 6.8-7.5，通气量为0.1-2.0vvm，转速为200-1000r/min，溶氧为10-30％。 7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述乳酸发酵的工艺还包含流加碱性中和剂维持pH在6.0-7.5的工艺；所述碱性中和剂为氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化镁、氨水中的一种或多种，优选氢氧化钙。 8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵产酸阶段还包含连续流加或分批补料葡萄糖的工艺。 9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述产酸阶段培养条件为温度控制37-50℃，优选为37-45℃，更优选为40-45℃，转速控制100-500rpm，更优选为100-300rpm。 10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述OD600为15-45时，更优选为20-30时加入丁二酸特异性抑制剂。浓度mM 乳酸g/L 丁二酸含量ppm 抑制率％ 0 145 2000 0 1 145.33 1565 21.75 3 145.43 1435 28.25 5 145.76 1000 50 7 145.93 780 61 10 146.24 375 81.25 浓度mM 乳酸g/L 丁二酸含量ppm 抑制率％ 0 142 1820 0 10 142.43 1250 31.32 12 142.55 1105 39.29 15 142.83 732 59.78 18 142.90 645 64.56 20 142.96 560 69.23 浓度mM 乳酸g/L 丁二酸含量ppm 抑制率％ 0 137.5 1750 0 0.2 137.90 1230 29.71 0.3 138.05 1025 41.43 0.5 138.30 700 60.00 0.7 138.56 355 79.71 1 138.57 345 80.29 浓度mM 乳酸g/L 丁二酸含量ppm 抑制率％ 0 142 1820 0 0.01 142.13 1645 9.62 0.03 142.62 1005 44.78 0.05 142.85 705 61.26 0.07 142.91 630 65.38 0.1 142.99 522 71.32 浓度mM 乳酸g/L 丁二酸含量ppm 抑制率％ 0 145 2000 0 0.01 145.48 1365 31.75 0.03 145.80 956 52.20 0.05 145.95 752 62.40 0.07 146.06 612 69.40 0.1 146.10 555 72.25 浓度mM 乳酸g/L 丁二酸含量ppm 抑制率％ 0 145 2000 0 0.01 145.31 1593 20.35 0.02 145.58 1235 38.25 0.03 145.92 795 60.25 0.04 146.23 387 80.65 0.05 146.53 0 100