ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMATIC CHEMILUMINESCENT SUBSTRATE

29-12-2016 дата публикации

Номер:

WO2016206654A2

Автор: QIN, Feng, MA, Zhufeng, WANG, Jing, ZHANG, Wei, LI, Qingchun

Принадлежит: 苏州浩欧博生物医药有限公司

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Номер заявки: CN67-09-201655

Дата заявки: 25-08-2016

一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物

技术领域

[1]

本发明涉及免疫技术检测领域，特别涉及一种可用于化学发光免疫检测的高效酶促化学发光底物。

背景技术

[2]

化学发光是指在一个反应体系中通过化学反应生成一种激发态的产物(C^*)，在其回到基态的过程中，释放出的能量转变成光子(能量hγ)，从而产生发光现象。

[3]

化学发光免疫分析是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术之后发展起来的一种超高灵敏度的微量检测技术，具备灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染等优点，因此成为世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术，是目前免疫定量分析最理想的方法。

[4]

在化学发光免疫分析中，常用发光物质包括鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1，2-二氧杂环丁烷化合物(1，2-dioxetane compound)。其中异鲁米诺和吖啶酯作为示踪分子直接标记，属于闪光型化学发光反应。鲁米诺和1，2-二氧杂环丁烷化合物依靠酶作为示踪分子标记，属于酶促辉光型化学发光反应。1，2-二氧杂环丁烷化合物是最新的超灵敏的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)底物，在适宜的缓冲液中，随着碱性磷酸酶(AP)的催化水解作用，1，2-二氧杂环丁烷化合物分解发出的信号可持续20小时以上，是理想的化学发光物质。国外生产厂家研制出以碱性磷酸酶(AP)为标记物，1，2-二氧杂环丁烷化合物-3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基)苯-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)为底物的试剂盒，与之相匹配的有DPC、Access Substrate、BioMerieux、Olympus全自动化学发光系统。

[5]

然而AP催化AMPPD的化学反应是水解反应，虽然具有较长的平台期，但是其发光强度较低，并且起光较慢，因此，该化学反应仍有待优化。

[6]

发明内容

[7]

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种发光信号强、进入平台期较快、持续时间长、常温保存期长的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物。

[8]

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

[9]

一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，其特征在于，所述化学发光底物以水为溶剂，并包括以下组分：

[10]

2-氨基-2-甲基-1-丙醇；

[11]

AMPPD；

[12]

以及脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光化合物偶联的发光增强剂(以下记作HOBEP系列化合物)。

[13]

脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光化合物的偶联可起到共表面活性剂的作用，能使该复合物更好的结合到化学发光缓冲体系中。

[14]

当HOBEP系列化合物溶于水后，在浓度较低时呈单分子分散状态，或被吸附在溶液的表面上，从而降低表面张力；而HOBEP系列化合物的浓度增加至溶液表面已经饱和而不能再吸附时，其分子即开始转入溶液内部，由于HOBEP系列化合物分子的疏水部分与水的亲和力较小，而疏水部分之间的吸引力较大，当达到一定浓度时，许多HOBEP系列化合物的疏水部分便相互吸引，缔合在一起，形成缔合体，即胶束，可触发从激发态裂解产物到荧光表面活性剂之间的能量转移，因此可大幅度提高化学发光效率。

[15]

其中，所述发光增强剂为通式(I)、通式(II)、通式(III)、通式(IV)、通式(V)所示化合物中的其中一种：

[16]

(1)HOBEP-1：脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与香豆素类荧光化合物偶联

[17]

[18]

(2)HOBEP-2：脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光素类荧光化合物偶联

[19]

[20]

(3)HOBEP-3：脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与萘酰亚胺类荧光化合物偶联

[21]

[22]

(4)HOBEP-4：脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与罗丹明类荧光化合物偶联

[23]

[24]

(5)HOBEP-5：脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与苯并咪唑类荧光化合物偶联

[25]

[26]

其中，

[27]

R₁选自C₁-C₂₈烷基的其中一种；

[28]

R₂选自以下取代基中的其中一种：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、烷氧基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰胺基；

[29]

n取5-10的整数。

[30]

在具体实施例中，所述酶促化学发光底物还包括MgSO₄、ZnCl₂及防腐剂。

[31]

作为优选的具体实施方式，本发明的酶促化学发光底物以水为溶剂，并包括以下组分：

[32]

[33]

该酶促化学发光底物还包括用于调节pH的盐酸，使得该酶促化学发光底物pH为10.0。即，用盐酸调节pH至10.0。

[34]

在具体实施例中，所述防腐剂为ProClin300。

[35]

本发明的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物(APSH)的空白发光强度不高于200，检测灵敏度达到10-19molAP。此外，将本发明的酶促化学发光底物分别于37℃放置10天，4℃放置18个月进行稳定性研究的结果表明，本发明提供的酶促化学发光底物(APSH)热稳定性及实时稳定性均极好，能达到化学发光仪器检测的要求。总体而言，本发明提供的新型化学发光底物(APSH)强度高，灵敏度高，持续时间长，可达30-60min，稳定性好，可完全满足临床检测的需要，其主要性能指标已达到国外产品水平，大大降低了化学发光底物的成本。

附图说明

[36]

图1为实施例二的酶促化学发光底物(ASPH)及贝克曼化学发光底物(Access Substrate)在不同浓度AP条件下信号强度差异比较示意图。

[37]

图2为实施例三的酶促化学发光底物(ASPH)反应动力学研究实验结果示意图。

具体实施方式

[38]

实施例一、酶促化学发光底物(APSH)的制备

[39]

(1)材料：2-氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD、MgSO₄及ZnCl₂均为市售，化学纯；ProClin300为美国Supelco公司生产的防腐剂；发光增强剂HOBEP-1为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与香豆素类荧光化合物偶联得到，发光增强剂HOBEP-2为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光素类荧光化合物偶联得到，发光增强剂HOBEP-3为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与萘酰亚胺类荧光化合物偶联得到，发光增强剂HOBEP-4为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与罗丹明类荧光化合物偶联得到，发光增强剂HOBEP-5为通过脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与苯并咪唑类荧光化合物偶联得到。

[40]

(2)以超纯水为溶剂，按表1.1，表1.2，表1.3分别制备最高浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-1，按表2.1，表2.2，表2.3分别制备最高浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-2，按表3.1，表3.2，表3.3分别制备最高浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-3，按表4.1，表4.2，表4.3分别制备最高浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促底物化学发光底物APSH-4，按表5.1，表5.2，表5.3分别制备最高浓度、最佳浓度和最低浓度的酶促化学发光底物APSH-5：

[41]

表1.1 APSH-1的配方一

[42]

[43]

表1.2 APSH-1的配方二

[44]

[45]

表1.3 APSH-1的配方三

[46]

[47]

表2.1 APSH-2的配方一

[48]

[49]

表2.2 APSH-2的配方二

[50]

[51]

表2.3 APSH-2的配方三

[52]

[53]

表3.1 APSH-3的配方一

[54]

[55]

表3.2 APSH-3的配方二

[56]

[57]

表3.3 APSH-3的配方三

[58]

[59]

表4.1 APSH-4的配方一

[60]

[61]

表4.2 APSH-4的配方二

[62]

[63]

表4.3 APSH-4的配方三

[64]

[65]

表5.1 APSH-5的配方一

[66]

[67]

表5.2 APSH-5的配方二

[68]

[69]

表5.3 APSH-5的配方三

[70]

[71]

实施例二、比较本实施例酶促化学发光底物(APSH)与贝克曼化学发光底物(Access Substrate)测试各梯度浓度AP信号强度及线性关系

[72]

分别采用按表1.2制备得到的化学发光底物ASPH-1、按表2.2制备得到的化学发光底物ASPH-2、按表3.2制备得到的化学发光底物ASPH-3、按表4.2制备得到的化学发光底物ASPH-4、按表5.2制备得到的化学发光底物ASPH-5以及市售的美国贝克曼公司的化学发光底物Access Substrate测试各梯度浓度AP条件下的信号强度(相对发光强度RLU)及线性关系，测试结果如下表6.所示。

[73]

表6.各种底物在不同浓度AP条件下信号强度差异比较

[74]

[75]

[76]

[77]

[78]

[79]

[80]

根据表6得到的各种底物在不同浓度AP条件下的信号强度数据，绘制本发明的五种酶促化学发光底物及贝克曼化学发光底物Access Substrate在不同浓度AP条件下信号强度差异比较示意图，如附图1所示。其中，在相同浓度AP条件下，底物信号强度从大到小依次为AMPPD+HOBEP-2、AMPPD+HOBEP-4.AMPPD+HOBEP-3、AMPPD+HOBEP-1、AMPPD+HOBEP-5、Access Substrate。

[81]

以上结果表明在相同浓度碱性磷酸酶(AP)作用下，本发明的酶促化学发光底物(APSH)信号强度明显高于贝克曼化学发光底物(Access Substrate)。

[82]

实施例三、比较本发明的酶促化学发光底物(APSH)与贝克曼化学发光底物Access Substrate测定促甲状腺激素(TSH)定量检测试剂盒(磁微粒化学发光法)的最低检测限(LOD)

[83]

分别采用按表1.2制备得到的化学发光底物ASPH-1、按表2.2制备得到的化学发光底物ASPH-2、按表3.2制备得到的化学发光底物ASPH-3、按表4.2制备得到的化学发光底物ASPH-4、按表5.2制备得到的化学发光底物ASPH-5以及市售的美国贝克曼公司的化学发光底物Access Substrate测定促甲状腺激素(TSH)定量检测试剂盒的最低检测限(LOD)。

[84]

应用双抗体夹心法检测人血清中TSH的含量，实验步骤如下：

[85]

1、在化学发光管中分别加入人血清样本20μL或TSH标准品、生物素标记的TSH抗体50μL、碱性磷酸酶标记的TSH抗体50μL，混匀后37℃反应30min；

[86]

2、加入500μL清洗液清洗3次；

[87]

3、加入链霉亲和素偶联的磁微粒50μL，混匀后37℃反应15min；

[88]

4、加入500μL清洗液清洗3次；

[89]

5、加入贝克曼化学发光底物(Access Substrate)或本发明的酶促化学发光底物(APSH)150μL，37℃反应5min；

[90]

6、化学发光仪检测发光强度RLU值。

[91]

结果如表7所示：

[92]

表7.APSH与Access Substrate检测TSH试剂盒的LOD比较

[93]

[94]

由表7.可知，本发明的酶促化学发光底物(APSH)检测TSH试剂盒最低检测限LOD为0.005～0.012IU/mL，贝克曼化学发光底物(Access Substrate)检测结果为0.026IU/mL，结果表明本发明的酶促化学发光底物(APSH)相比贝克曼化学发光底物Access Substrate在配套试剂盒检测灵敏度方面优势明显。

[95]

实施例四、热稳定性研究

[96]

对按表1.2制备得到的化学发光底物ASPH-1、按表2.2制备得到的化学发光底物ASPH-2、按表3.2制备得到的化学发光底物ASPH-3、按表4.2制备得到的化学发光底物ASPH-4、按表5.2制备得到的化学发光底物ASPH-5分别进行37℃ 10天热稳定性实验以及实时稳定性实验，实验结果如表8、表9所示：

[97]

表8.APSH热稳定性研究

[98]

[99]

表9.APSH实时稳定性研究

[100]

[101]

由表8和表9的信号保留率数据可知，本发明的酶促化学发光底物(APSH)热稳定性实验以及实时稳定性实验的信号保留率均大于95％，结果表明本发明的酶促发光底物可以长期稳定保存，能达到化学发光仪器检测的要求。

[102]

实施例五、反应动力学研究

[103]

对按表1.2制备得到的化学发光底物ASPH-1、按表2.2制备得到的化学发光底物ASPH-2、按表3.2制备得到的化学发光底物ASPH-3、按表4.2制备得到的化学发光底物ASPH-4、按表5.2制备得到的化学发光底物ASPH-5、贝克曼贝克曼化学发光底物Access Substrate以及APSH不加入HOBEP系列化合物的化学发光底物进行反应动力学研究，实验结果如附图2所示。

[104]

由附图2可知，本发明5种不同的酶促化学发光底物(APSH)反应15min后信号强度达到平台期，其中本发明的新型化学发光底物(APSH)的信号强度明显高于贝克曼化学发光底物Access Substrate；并且本发明的酶促化学发光底物(APSH)中HOBEP系列化合物可以大幅度提高化学发光效率。

[105]

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

[1]

The present invention relates to an alkaline phosphatase enzymatic chemiluminescent substrate. The enzymatic chemiluminescent substrate uses water as a solvent, and also comprises the following components: 2-amino-2-methyl-1-propanol; AMPPD; a luminescence enhancer which is sodium fatty alcohol polyoxyethylene ether carboxylate coupled with a fluorescent compound. The luminescence enhancer has a co-surfactant effect, allowing the complex to be better combined into a chemiluminescent buffer system, thereby significantly increasing the chemiluminescent efficiency. The alkaline phosphatase enzymatic chemiluminescent substrate has advantages such as high strength, high sensitivity, a long duration and good stability, and fully satisfies clinical detection requirements. A main performance indicator of the chemiluminescent substrate reaches a foreign product level, and the costs of the chemiluminescent substrate are significantly reduced.

[2]

一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，其特征在于，所述酶促化学发光底物以水为溶剂，且还包括以下组分：

2-氨基-2-甲基-1-丙醇；

AMPPD；

脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠与荧光化合物偶联的发光增强剂。

根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，其特征在于：所述发光增强剂为通式(I)、通式(II)、通式(III)、通式(IV)、通式(V)所示化合物中的其中一种：

其中，

R₁选自C₁-C₂₈烷基的其中一种；

R₂选自以下取代基中的其中一种：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、烷氧基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰胺基；

n取5-10的整数。

根据权利要求2所述的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，其特征在于：所述酶促化学发光底物还包括MgSO₄、ZnCl₂及防腐剂。

根据权利要求3所述的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，其特征在于：所述酶促化学发光底物以水为溶剂，并包括以下组分：