PREPARATION METHOD FOR FUNCTIONAL BIODEGRADABLE NANO-PARTICLES BASED ON POLYAMINO ACID

基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子的制备方法 技术领域

本发明涉及一种聚合物粒子， 具体涉及一种基于聚氨基酸的功能性生物可降解 纳米粒子的制备方法。

背景技术

聚 （乳酸 -羟基乙酸） （PLGA) 是一种 FDA批准的生物可降解聚合物， 被广泛 地应用于手术缝合线、 组织工程支架、 药物控制释放载体等生物医用领域。 基 于 PLGA的生物可降解纳米粒子和微米粒子已成为实现药物靶向长效治疗的最重 要载体之一。 例如， 多种包载蛋白药物和多肽药物的 PLGA微球如 Depot ® ， Decapeptyl ®, Somatulline ® , Nutropin ®, Depot ®, 已被临床用于治疗前列腺 癌、 肢端肥大症、 生长激素缺乏症。 PLGA纳米粒子和微米粒子通常是用乳化-溶 剂挥发法或纳米沉淀法制备， 这通常要用表面活性剂来稳定分散的小液滴， 减 小表面张力和防止絮积。 聚乙烯醇 （PVA) 、 泊洛沙姆 （poloxamer) 和聚丙烯 吡咯烷酮 （PVP) ) 等表面活性剂因具有在水溶液中粘度高， 能很好地吸附在分 散小液滴的表面等优点而成为制备 PLGA纳米粒子和微米粒子最常用的表面活性 齐 1J。 但这些表面活性剂存在不能生物降解、 体内存在潜在的毒性、 缺少功能基 团等缺点。 例如， PVA不仅可能致癌， 而且动物实验发现皮下或静脉注射 PVA 会导致高血压、 器官损伤、 贫血、 中枢神经抑制等问题 （J. Biomed. Mater. Res. Part A: 100A; 1998-2005, 2012) 。

最近， 聚乙二醇 1000维生素 E琥珀酸酯 （TPGS) 作为一种生物相容性表面活性 剂被广泛用于纳米粒子制备 （Biomaterials 33; 4889-4906,

2012) 。 例如， 用 TPGS制备得到了一系列包裹紫杉醇等药物的 PLGA、 聚乳酸 (PLA) 、 聚乙二醇-聚乳酸 （PEG-PLA) 纳米粒子； 这些纳米粒子的粒径可控 制在 200-800nm之间。 与传统 PVA乳化剂相比， TPGS展现出了更好的乳化效果 和包载效率。

技术问题 研究还发现 TPGS乳化剂能通过抑制肿瘤细胞表面 P-糖蛋白功能来阻止抗癌化 疗药物被细胞泵出， 从而大大增强抗癌药物 （阿霉素、 紫杉醇、 多西紫杉醇等 ) 对耐药肿瘤细胞的毒性。 而且， TPGS还被发现本身就有抗癌活性， 能抑制移 植在裸鼠身上的人肺癌细胞的生长。 但用 TPGS乳化的 PLGA等纳米微球通常稳 定性较低， 而且表面很难进行功能化。

问题的解决方案

技术解决方案

本发明的目的是提供一种基于聚氨基酸的纳米粒子， 可用来作为纳米药物载体

[0006] 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案是： 一种基于聚氨基酸的功能性生物 可降解纳米粒子的制备方法， 包括如下步骤：

(1) 以疏水性羟基化合物、 对硝基苯基氯甲酸酯为原料， 在无水二氯甲烷和 吡啶中， 反应得到对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子； 然后以对硝 基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺化合物为反应物， 在无水二氯 甲烷和吡啶中， 反应制备疏水性胺基化合物；

[0008] (2) 以疏水性胺基化合物作为引发剂， 幵环聚合 a-氨基酸 -N-羧基内酸酐化合 物得到基于聚氨基酸的聚合物； 所述 a-氨基酸 -N-羧基内酸酐化合物为 γ-寡聚乙 二醇 -L-谷氨酸 -Ν-羧基内酸酐或 β-寡聚乙二醇 -L-天冬氨酸 -Ν-羧基内酸酐；

[0009] (3) 将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中， 然后逐滴加入 PLGA、 PLA、 PCL 或 PEG-PLA的丙酮溶液， 搅拌得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子

[0010] 上述技术方案中， 步骤 （1) 中， 疏水性羟基化合物包括维他命E、 胆固醇、 香 豆素、 胆酸、 喜树碱、 伊立替康； 二胺化合物选自以下化合物中的一种： 乙二 胺、 丁二胺、 辛二胺、 赖氨酸甲酯、 赖氨酸乙酯、 鸟氨酸甲酯、 鸟氨酸乙酯、 胱氨酸甲酯、 胱氨酸乙酯、 胱胺； 步骤 （1) 中， 疏水性羟基化合物、 对硝基苯 基氯甲酸酯和吡啶的摩尔比为 1:2:5; 对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小 分子、 乙二胺和吡啶的摩尔比为 1:20:20。

上述技术方案中， 步骤 （1) 中， 制备对硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水 小分子吋， 在 0°C度条件下滴加对硝基苯基氯甲酸酯， 再在 30°C反应 24小吋； 制 备疏水性胺基化合物吋， 反应温度为室温， 吋间为 24小吋。

[0012] 上述技术方案中， 步骤 （2) 中， 疏水性胺基化合物、 a-氨基酸 -N-羧基内酸酐 化合物的摩尔比为 1:3〜25； 疏水性胺基化合物的分子量大于 240; 步骤 （2) 中 ， 制备基于聚氨基酸的聚合物吋， 反应温度是 25〜50°C， 反应吋间为 12〜72小吋

[0013] 上述技术方案中， 步骤 （3) 中， 将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水中， 然后 在 EDC/NHS催化条件下， 与短肽、 单糖、 叶酸、 生物素或者抗体分子反应， 制 得含靶向分子表面活性剂； 然后含靶向分子表面活性剂中逐滴加入 PLGA、 PLA 、 PCL或 PEG-PLA的丙酮溶液， 得到基于聚氨基酸的功能性生物可降解纳米粒子 ； 步骤 （3) 中， 在室温下搅拌挥发除去有机溶剂， 离心收集得到基于聚氨基酸 的功能性生物可降解纳米粒子。

本发明公幵的基于聚氨基酸的聚合物的化和结构式可以为：

[0017] 疏水功能小分子！^作为憎水的头， 水溶的聚 （γ-寡聚乙二醇 -L-谷氨酸） 和聚

(β-寡聚乙二醇 -L-天冬氨酸） 的聚氨基酸链段作为亲水的尾巴， 其中 为2〜5， η为 3〜20； R i分子量大于 240 Da。 疏水性羟基化合物包括维他命E、 胆固醇、 香豆素、 胆酸、 喜树碱、 伊立替康 等， 其结构式如下：

二胺化合物结构为

， 选自以下化合物中的一种： 乙二胺、 丁二胺、 辛二胺、 赖氨酸甲酯、 赖氨酸 乙酯、 鸟氨酸甲酯、 鸟氨酸乙酯、 胱氨酸甲酯、 胱氨酸乙酯、 胱胺等， 其具体 结构如下：

.；....../

^ ^v議

其中 y为 2， 4， 8。

上述制备过程可表示如下：

(1) 中间体对硝基苯基氯甲酸酯活化的疏水小分子 （R i-4-NC) 的制备： 在 0 ^条件下， 将对硝基苯基氯甲酸酯的二氯甲烷溶液滴加到疏水性羟基化合物和吡 啶的二氯甲烷溶液中。 滴加完毕后， 将反应液转移到 30°C油浴中反应 24小吋后过 滤将除去吡啶盐， 旋蒸除去二氯甲烷得到粗产品。 将粗产品溶解在石油醚中， 然后在 -5°C度离心除去不溶物， 再旋蒸除去溶剂得到黄色油状的中间体 R 4-NC ； 末端氨基的疏水小分子 （R_rNH₂) 的制备： 将对硝基苯基氯甲酸酯活化的疏 水小分子 （R_r4-NC) 溶解在无水二氯甲烷溶液中， 用恒压滴液漏斗 10秒每滴滴 加到二胺和吡啶的溶液中， 室温反应 24小吋后， 用去离子水洗涤， 有机相用无 水硫酸镁干燥过夜， 过滤， 旋转蒸发除去二氯甲烷， 真空干燥 24小吋， 得到产 品。 干燥后， 抽滤除去硫酸镁， 收集有机相滤液， 旋转蒸发除去二氯甲烷， 并 真空干燥 24小吋， 得到末端氨基的疏水小分子 （R_rNH₂) ；

(2) 将步骤 （1) 制备的末端氨基的疏水小分子 （R_rNH₂) 溶解在无水二氯 甲烷或二甲基甲酰胺中并置于密闭反应器中， 再将 γ-寡聚乙二醇 -L-谷氨酸 -N-羧 基内酸酐 （EG_X-G1_U-NCA) 或 β-寡聚乙二醇 -L-天冬氨酸 -N-羧基内酸酐 （EG_χ -Asp-NCA) 的二氯甲烷或二甲基甲酰胺溶液在氮气环境下快速加入到引发剂溶 液中， 然后在 25〜50°C反应 12〜72小吋。 反应结束后， 将反应液用冰乙醚沉淀， 离心， 真空干燥， 得到基于聚氨基酸的聚合物；

末端氨基的疏水小分子 （R rNH₂

) 与 γ-寡聚乙二醇 -L-谷氨酸 -N-羧基内酸酐 （EG_X-G1_U-NCA) 或 β-寡聚乙二醇 -L- 天冬氨酸 -Ν-羧基内酸酐 （EG_X-Asp-NCA) 的摩尔比根据需要控制在 1:3〜25。 所 用有机溶剂可以是二氯甲烷、 三氯甲烷、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺、 二甲基亚砜、 Ν- 甲基 -2-吡咯烷酮， 本发明优选二氯甲烷。

0027] 上述制备方法可表示如下：

本发明公幵的由上述末端氨基的疏水小分子 （R ,-NH₂) 引发 γ-寡聚乙二醇 -L- 谷氨酸 -Ν-羧基内酸酐 （EG_X-Glu-NCA) 或 β-寡聚乙二醇 -L-天冬氨酸 -N-羧基内 酸酐 （EG_X-Asp-NCA) 聚合制备的聚合物， 其分子量为 0.5〜6.5 kDa， 其中聚氨 基酸的重量百分数为 20〜95%。 其末端胺基可用来连接生物活性分子， 这些生物 活性分子包括但不仅限于靶向分子： cRGD、 iRGD、 AP、 奥曲肽、 ACUPA等短 肽分子， 抗体及其片段、 铁转移蛋白等蛋白分子， 半乳糖 （Gal) 和透明质酸等 单糖或多糖分子， 叶酸， 生物素等； 和穿膜分子： TAT、 Angiopep-2. iRGD、 T 7、 Cilengitide等。

(3) 先将基于聚氨基酸的聚合物溶解在水等溶剂中， 然后在 EDC/NHS催化条 件下， 与短肽、 单糖、 叶酸、 生物素、 抗体等生物活性分子反应， 制得含靶向 分子等生物活性分子的表面活性剂； 然后向该表面活性剂的水溶液中逐滴加入 P LGA、 PLA、 PCL或 PEG-PLA等生物相容性聚合物的丙酮溶液， 再在室温下搅拌 挥发除去有机溶剂， 离心收集到表面含有靶向分子等生物活性分子的多功能性 纳米粒子。 由于上述聚合物由功能性疏水小分子和亲水聚氨基酸组成， 因此具 有良好的生物相容性和生物降解性。 同吋憎水功能性疏水小分子头和亲水聚氨 基酸尾巴都有大分子结构和大表面积， 具备成为优良表面活性剂的基本特征。 而且， 聚合物亲水链段长度能通过调节聚氨基酸的聚合度来控制， 从而得到不 同亲疏水比例的聚合物， 可方便制备具有不同乳化性能的聚合物。 另外， 聚氨 基酸亲水链段的末端含有胺基， 可用来引入靶向分子等生物活性分子， 从而制 得多功能的纳米药物载体， 负载药物用于肿瘤的安全高效治疗。

[0030] 也可以不加入靶向分子， 制备得到纳米粒子， 可以负载多种药物， 用于多种疾 病的体内治疗。

本发明还公幵了一种药物， 包括疏水药以及上述方法制备的基于聚氨基酸的功 能性生物可降解纳米粒子； 疏水药包括紫杉醇、 多西紫杉醇、 喜树碱、 伊立替 康、 长春新碱、 拓扑替康、 贝洛替康、 长春瑞滨。

发明的有益效果

有益效果

1、 本发明用基于聚氨基酸的聚合物作为高分子表面活性剂与 PLGA、 PLA、 PC L或 PEG-PLA等生物相容性聚合物制备的多功能纳米药物载体的表面由聚氨基酸 链段构成， 很好克服了现有大多纳米粒子表面由聚乙二醇构成所带来的不能生 物降解、 容易引发过敏反应和很难进行纳米粒子表面修饰等问题； 亲水聚氨基 酸链不仅具有很好的生物降解性， 而且其末端的胺基能方便在纳米粒子表面引 入靶向分子和穿模肽等生物活性分子， 从而增强纳米药物在病灶处的富集量。

2、 本发明公幵的基于聚氨基酸的生物可降解聚合物作为高分子表面活性剂能 很好克服现有高分子表面活性剂 （PVA， poloxamer, PVP等） 不具有生物可降 解性、 生物相容性不好、 很难进行官能化修饰等缺点； 以其作为表面活性剂与 P LGA、 PLA、 PCL或 PEG-PLA等生物可降解聚合物聚合制备药物载体， 成功解决 了现有载体存在的不能生物降解、 体内存在潜在的毒性、 缺少功能基团等缺点 ， 取得了意想不到的技术效果。 本发明的实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一引发剂维他命 E氨基 （VE-NH₂) 的合成

(1) 中间体 VE-4-NC的制备： 氮气环境下， 将对硝基苯基氯甲酸酯 （4-NC， 1 .98 g, 9.8 mmol) 的二氯甲烷 （30 mL) 溶液在 0°C条件下以 5秒一滴的速度滴加到 维他命 E (VE， 2.12 g, 4.9 mmol) 和吡啶 (1.98 mL, 24.5

mmol) 的二氯甲烷 （10 mL) 溶液中。 滴加完毕后， 转移到 30°C油浴中反应 24小 吋。 反应后， 过滤除去副产物吡啶盐， 再用旋转蒸发仪旋干滤液， 得到淡黄色 粘稠的 VE-4-NC粗产品。 然后用石油醚 （b.p: 60-90 °C) 溶解粗产品， 离心除去 杂质， 旋蒸、 最后真空干燥得到黄色粘稠油状产品 VE-4-NC, 产率 93.4%;

(2) 引发剂维他命 E氨基 （VE-NH₂) 的制备： 氮气环境下， 将步骤 （1) 制 备的对硝基苯基氯甲酸酯活化的 VE-4-NC (0.6 g, 1.0 mmol) 的二氯甲烷 （14 mL ) 溶液用恒压滴液漏斗 10秒每滴滴加到乙二胺 （1.35 mL, 20.0

mmol) 和吡啶 （ 1.6 mL, 20 mmol) 混合的二氯甲烷 （4 mL) 溶液中， 室温磁力 搅拌反应 24小吋。 然后加入一定体积的二氯甲烷， 并用去离子水萃取， 直到水 相变得没有颜色。 将收集到的二氯甲烷相用无水硫酸镁在 -24°C条件下干燥 24小 吋， 抽滤除去硫酸镁， 旋转蒸发除去二氯甲烷， 最后真空干燥 24小吋， 得到黄 色粘稠油状产品 VE-NH₂， 产率 78.1%。

VE-NH₂核磁表征； 'HNMR (400MHz, CDC1₃)： δ 3.33 (t, -NHCH₂CH₂NH₂);

2.90 (t, -NHCH₂CH₂NH₂); 2.58 (t, -Ph(CH₃)₃CH₂CH₂-); 2.08, 2.02 (s, -Ph(CH₃)₃ -);1.77(t,-Ph(CH₃)₃CH₂CH₂-);1.52(m,CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃

-);1.37-1.07(m,CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-;s,-C(CH₃)O-);0.87-0.83(d,CH₃ (CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-)。

将维他命 E更换为胆固醇， 可以制备引发剂胆固醇氨基 （Chol-NH₂) ； Ή

NMR (400 MHz, CDC1₃)： δ 5.37 (t, -CH=C-); 4.49 (m, -(-CH₂)₂CHOCONH-); 3.21 (t, -NHCH₂CH₂NH₂); 2.8 l(t, -NHCH₂CH₂NH₂); 2.34,2.27(d, -CH=CCH₂CH(-CH₂ ) 0-)。 实施例二维他命 E-聚 （γ-二乙二醇单甲醚 -L-谷氨酸） （VE-poly(EG₂-Glu)) 的 合成

将引发剂维他命 E氨基 VE-NH₂ (1.16 g, 2.25 mmol) 溶于 37 mL二氯甲烷溶剂中 并置于密闭反应器中。 氮气环境下， 将 γ-二乙二醇单甲醚 -L-谷氨酸 -N-羧基内酸 酐 （EG 2-Glu-NCA) (3.71 g, 13.50 mmol) 单体的二氯甲烷溶液 （37 mL) 快速 加到引发剂中， 25 °C反应 12小吋。 反应过程用傅里叶红外光谱仪监测。 反应结 束后， 将反应液旋转蒸发浓缩至约 18毫升， 用冰乙醚沉淀， 低温离心 （-5°C, 5000 rpm) 收集沉淀。 最后用冰乙醚洗涤三次， 真空干燥 48小吋， 得到淡黄色产 品， 产率 55.8%。

VE-poly(EG₂-Glu)核磁表征； NMR (600 MHz, CDC1₃)： δ 4.24 (m,

-NHCOCH-; t, CH₃OCH₂CH₂OCH₂CH₂-); 3.68-3.54 (m, CH₃OCH₂CH₂OCH₂CH 2-); 3.40-3.36 (t, -NHCH₂CH₂NH-; s, CH₃OCH₂CH₂OCH₂CH₂-); 2.66-2.34 (t, -Ph(CH₃)₃CH₂CH 2-, t,-COCH(NH)CH₂CH₂-); 2.07, 2.03 (s, -Ph(CH₃)₃-);

1.99-1.88 (m, -COCH(NH)CH₂CH₂-); 1.78 (t, -Ph(CH₃)₃CH₂CH₂-); 1.53 (m, CH₃ (CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-)； 1.37-1.07 (m, CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-； s,-C(CH₃)(CH₂)-); 0.87-0.83 (d,CH₃(CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂)₃-)。

将引发剂维他命 E氨基 VE-NH₂更换为引发剂胆固醇氨基 （Chol-NH₂) ， 得到 淡黄色固体 Chol-poly(EG₂-Asp)_19Λ , 产率 62.1<¾。 Ή NMR (400 MHz, CDC1₃): δ 5.35 (t, -CH=C-); 4.46 (m, -(-CH₂)₂CHOCONH-); 4.24 (m, -NHCOCH-; t, CH₃OCH 2CH₂OCH₂CH₂-) 3.65-3.54 (m, CH₃OCH₂CH₂OCH₂CH₂-); 3.42-3.34 (t, -NHCH₂ CH₂NH-; s, CH 3OCH₂CH₂OCH₂CH₂-)。

用相似的方法， 通过选用不同单体 （EG x-Glu-NCA或 EG x-Asp-NCA) 和控制 单体 /引发剂的投料比， 可以制备得到一系列聚合度不同的 VE-poly(EG_X-Glu)_n 和 VE-poly(EG_X-Asp)_n两亲性聚合物， 其表征见表 1。

表 1聚合物 V E-poly(EG_X-Glu) _X-Asp)„的制备和表征。

[]

用相似的方法， 选用不同的引发剂如香豆素胺基化合物 （Cou-NH₂) 、 胆酸胺 基化合物 （CA-NH₂) 、 喜树碱胺基化合物 （CPT-NH₂) 、 伊立替康胺基化合物 (INT-NH 2

) 、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 （DSPE) 、 二油酰基磷脂酰乙醇胺 （DOPE) 艾日布林 （Eri) 和十六烷基胺 （THDA) ， 幵环聚合 NCA单体可制得一系列疏 水功能性小分子-亲水聚氨基酸聚合物， 其表征见表 2

[0047] 表 2疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸聚合物的制备和表征。

实施例三用 VE-poly(EG_X-Glu)_n为高分子表面活性剂制备 PLGA纳米粒子

[0049] PLGA纳米粒子 （PLGA NPs) 的制备： 以 VE-poly(EG₂-Glu)₅为高分子表面活 性剂为例， 将 0.9 mL PLGA的丙酮溶液 （10 mg/mL) 逐滴滴加到 9 mL

VE-poly(EG 2-Glu)₅水溶液 （0.45 mg/mL) 中， 室温搅拌 6 h， 使丙酮挥发， 然后 离心 （12000 rpm, 10 min, 4 °C; Sorvall Biofuge Stratos, Thermo Scientific) 收集纳 米粒子， 并用二次水洗一次， 除去自由的乳化剂， 制备得到表面含 VE-poly(EG₂ -Glu) PLGA纳米粒子。 纳米粒子的粒径和粒径分布可用动态光散射测量分别 为 135 nm和 0.06。 纳米粒子表面含有 VE-poly(EG₂-Glu)₅聚氨基酸链段可通过 X射 线光电子能谱观察到 N峰的出现得到证实。 而且， 纳米粒子表面含有表面活性剂 的量可用氢谱核磁具体测得， 通过比较表面活性剂上 EG₂在 d 3.54-3.68的亚甲基 和 PLGA在 d 5.21处的次甲基的峰面积， 可计算出 PLGA表面含有 7.3

\¥ %的 VE-poly (EG₂-Glu)₅。 通过调节 VE-poly (EG₂-Glu)₅为高分子表面活性剂的 浓度为 0.15， 030 mg/mL, 可以制备得到粒径在 150 nm的纳米粒子 （表征结果见 表 3) 。

实施例四表面含有靶向分子的 PLA纳米粒子的制备

先将靶向分子连接到高分子表面活性剂的亲水聚氨基酸链段的末端。 以连接 A CUPA短肽靶向分子到 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄.₄聚合物为例， 首先将聚合物末端胺基 转化为羧基， 具体方法如下： 将 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄₄ (900 mg, 0.20 mmol) ， 丁 二酸酐 （24.0 mg, 0.24 mmol) ， DMAP (24.4 mg, 0.20 mmol) 和三乙胺 （20.4 mg, 0.20 mmol) 溶解在 9毫升的无水 1,4-二氧六环中， 室温搅拌 24小吋； 反应结 束， 旋蒸除去溶剂， 再用少量二氯甲烷溶解， 然后过滤收集滤液， 用无水乙醚 沉淀， 离心， 最后真空干燥， 得到 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄₄-COOH， 产率 78.1<¾。 接 着， 用 EDC/NHS活化 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄.₄-COOH末端羧基， 将 VE-poly(EG₃ -Glu)₁₄₄-COOH (680mg， 0.15 mmol) ， NHS (51.8 mg, 0.45

mmol) 和 EDC (57.5 mg, 0.30 mmol) 溶解在二氯甲烷 （6.8

mL) 中， 室温反应 24小吋后， 用无水乙醚沉淀， 离心， 真空干燥， 得到 VE-poly (EG 3-Glu) 14.4-NHS , 产率 87.1<¾。 最后， 将制得的 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄.₄-NHS与含 氨基的 ACUPA靶向分子反应， 具体的， 先将 ACUPA (44.7 mg, 0.14 mmol) 和 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄₄-NHS (585mg， 0.13 mmol) 溶解在 DMF (6 mL ) 中， 再在 30°C反应 2天。 反应后， 用无水乙醚沉淀， 离心， 真空干燥， 得到带 靶向分子的 VE-poly(EG₃-Gl_U)₁₄.₄-ACUPA聚合物， 产率 77.9%。 然后， 按照实施 例三类似的方法用 VE-poly(EG₃-Glu)₁₄₄-ACUPA为高分子表面活性剂制备得到表 面含有 ACUPA靶向分子的 PLA纳米粒子， 该纳米粒子表面含有的靶向分子密度 可以通过调节高分子表面活性剂的浓度来控制。

用相似方法可以将其它靶向分子如 cRGD、 iRGD、 AP、 奥曲肽、 TAT、 Angiop ep-2、 iRGD、 T7、 Cilengitide、 抗体及其片段、 半乳糖 （Gal) 、 叶酸、 生物素 等连接到纳米粒子表面， 从而实现纳米粒子的表面功能化和作为药物载体包载 药物后纳米药物的靶向输送。

表 3用 VE-poly(EG2-Glu)₅表面活性剂制备 PLGA纳米粒子 （PLGA NPs) 及在其 表面引入透明质酸 （HA) ， 制得表面交联且含靶向分子的纳米粒子 （HA-PLGA NPs 表征

[]

实施例五表面可逆交联且含有转铁蛋白 （Tf) 靶向分子的 PCL纳米粒子的制备 首先将转铁蛋白的 N-糖苷链氧化制备醛基官能化的转铁蛋白 （Tf-CHO) ， 将 转铁蛋白 （Tf， 25 mg) 溶解在 900 μί的醋酸钠 （0.1 Μ， ρΗ 5.5) 溶液中， 再向 其加入 225 高碘酸钠溶液 （50 mM) ， 在室温下反应 1 h后。 反应后， 在 4°C条 件下用 Sephadex G-25色谱柱 （1.8 x 25 cm) 提纯 （流动相为醋酸钠 （0.1 M， pH 5.5) 溶液） ， 制备得到 Tf-CHO。 将 Ch₀l-p₀ly(EG₂-A_Sp)_ll 的末端胺基转化为羧 基， 接着， 用 EDC/NHS活化； 接着与 Tf-CHO反应得到靶向聚合物； 然后， 用靶 向聚合物为高分子表面活性剂制备 PCL纳米粒子， 将 0.9 mL PCL的丙酮和四氢呋 喃溶液 （10 mg/mL) 逐滴滴加到 9 mL靶向聚合物水溶液 （0.45 mg/mL) 中， 室 温搅拌 6 h， 使丙酮和四氢呋喃挥发， 然后离心收集纳米粒子， 并用二次水洗一 次， 除去自由的乳化剂， 制备得到表面含转铁蛋白 （Tf) 靶向分子的 PCL纳米粒 子。 动态光散色结果显示该纳米粒子的平均直径约为 150 nm。

[0056] 实施例六纳米粒子对疏水药物的装载及体外释放

用纳米粒子包载疏水药物紫杉醇 （PTX) 为例， 先将 PTX和 PLGA (理论载药 量 8 wt.%) 溶解到丙酮溶液中， 再逐滴滴加该溶液到 VE-poly(EG₂-Glu)₅高分子 表面活性剂的水溶液 （0.45 mg/mL) 中， 室温搅拌 6 h， 使丙酮挥发， 然后离心 收集纳米粒子， 并用二次水洗涤除去自由的乳化剂， 制备得到包载有 PTX的 PLG A纳米粒子 （PTX-PLGA NPs) 。

纳米粒子的粒径和粒径分布可用动态光散射测量分别为 164 nm和 0.16。 纳米粒 子的载药量可用高效液相色谱 （HPLC) 测定。 先取 0.2 mL PTX-PLGA NPs的溶 液， 冻干称重。 再用水和乙腈 （50:50, v/v) 重新溶解， 经 0.45 μηι滤膜过滤后， 用 HPLC测定载药量 （DLC) 和载药效率 （DLE) 分别为 6.4 wt.^<¾和80.1^<¾。 用相 似的方法可用 VE-poly(EG₂-Glu)₅高分子表面活性剂制备纳米粒子实现对其它憎 水性药物如多西紫杉醇 （DTX) 、 喜树碱 （CPT) 、 伊立替康 （INT) 、 长春新 碱 （VCR) 、 拓扑替康 （TPT) 、 贝洛替康 （BLT) 、 长春瑞滨 （NVB) 、 阿霉 素 （DOX) 等的包载， 其结果见表 4。

表 4用 VE-poly(EG₂-Glu)₅制备的包载疏水药物的纳米粒子

PTX的体外释放实验是在 37 °C恒温摇床中震荡 （200 rpm) 进行， 有三个平行 样。 将 0.5 mL的 PTX-HA-PLGA NPs载药纳米粒子溶液置于透析袋 （MWCO 12000-14000 Da, Spectrum Laboratories,

USA) 中， 然后将该透析袋放到含有吐温 80 (0.1%, v/v) 的 PB (10 mM, pH 7.4 ) 缓冲溶液 （25 mL) 中进行体外释放实验。 每间隔一定吋间， 从释放介质中取 出 5.0 mL溶液用作测试， 同吋向试管中补加 5.0 mL相应介质。 将取出的释放介质 溶液冻干， 再加入 0.5 mL乙腈 /7j (1:4, v/v) 溶解， 然后用 HPLC测定溶液中药物 浓度， 最终观察到 PTX从 PTX-HA-PLGA NPs累计释放量随吋间变化的行为， 结 果表明在 PB (10 mM, pH 7.4) 介质中， 大约有 54.0%的 PTX在 7天后从 HA-PLGA NPs中释放出来。

实施例七 MTT法分析空纳米粒子 （HA-PLGA NPs) 的细胞毒性

[0062] 选用正常细胞 （小鼠成纤维 L929细胞） 和肿瘤细胞 （人乳腺癌 MCF-7,人脑胶 质瘤 MG U87) 用 MTT法测试 HA-PLGA NPs的细胞毒性。 首先将细胞种在 96孔 板上 （1x104个细胞 /孔） ， 经 24小吋培养至细胞贴壁约 70%。 然后， 加入不同浓 度 （10-350

g/mL) 的 HA-PLGA空纳米粒子样品。 培养 48小吋后， 向每孔加入 10 的 MTT (5.0 mg/mL) 溶液， 再接着培养 4小吋。 随后， 向每孔加入 150 DMSO溶解 生成的结晶子， 并用酶标仪于 492 nm处测吸光度值 （A) ， 计算细胞存活率。 用 细胞空白对照孔和培养基空白孔为参照。 测试结果表明空纳米粒子导致肿瘤细 胞的存活率明显降低。 例如 MCF-7肿瘤细胞与 350 g/mL的空纳米粒子作用后， 其存活率下降到约 60%。 这说明本发明的聚合物作为高分子表面活性剂制得的 P LGA

NPs对肿瘤细胞具有一定的杀伤力。 相反， L929正常细胞即使与浓度高达 350 g/mL的空纳米粒子作用， 其存活率仍然大于 90%。 这说明本发明的聚合物作为 高分子表面活性剂制得的 PLGA NPs具有良好的生物相容性， 克服了现有乳化剂 有毒、 生物相容性差的缺陷。

[0063] 实施例八载药纳米粒子 （PTX-HA-PLGA NPs) 体外细胞毒性

[0064] 用 MTT法分析 PTX-HA-PLGA NPs对 MCF-7 (表面过度表达 CD44受体） 肿瘤细 胞的毒性。 首先将细胞种在 96孔板上 （1x10⁴个细胞 /孔） ， 经 24小吋培养至细胞 贴壁约 70<¾。 然后， 加入 PTX-HA-PLGA

NPs， PTX浓度范围选定为 0.0005、 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 1、 2.5 、 5和 10 g/mL。 培养 4小吋后， 吸出含载药纳米粒子的培养液， 然后添加新鲜培 养基继续孵育 44 h。 再向每孔加入 ΙΟ μί的 MTT (5.0 mg/mL) 溶液， 接着培养 4 小吋。 随后， 向每孔加入 150 L DMSO溶解生成的结晶子， 并用酶标仪于 492 nm处测吸光度值 （A) ， 计算细胞存活率。 实验用 PTX临床制剂 Taxol作对照。 另外为证实表面含 HA的纳米粒子具有靶向性， 我们添加了一组细胞表面受体封 闭实验， 具体方法是： 首先将 MCF-7细胞与过量的 HA大分子 （5 mg/mL) 孵育 4 h， 使 HA大分子结合并占据了细胞表面的 CD44受体， 然后再加入 PTX-HA-PLGA NPs , 分析其细胞毒性。 实验结果显示 PTX-HA-PLGA NPs对过量表达 CD44受体 的 MCF-7肿瘤细胞有较高毒性， 其半致死浓度 （IC₅。= 0.37

g/mL) 低于 Taxol (IC₅。= 0.82 g/mL) ， 这说明载药纳米粒子在体外有较高的 抗肿瘤活性。 另外， 载药纳米粒子对表面受体封闭后的 MCF-7细胞的毒性大大降 低， 其 IC₅。为 2.16 g/mL， 这说明 PTX-HA-PLGA NPs主要是通过受体介导方式 进入肿瘤细胞， 具有很好的肿瘤靶向性。

[0065] 实施例九载药纳米粒子 （PTX-HA-PLGA NPs) 的体内抗肿瘤活性

[0066] 体内抗肿瘤活性实验是用荷 MCF-7人乳腺癌 Balb/c裸鼠 （18~20克， 4~6周齢） 进行。 首先通过在裸鼠皮下注射 MCF-7人乳腺癌细胞 （5x10⁶个 /只） 建立皮下乳 腺癌肿瘤模型， 等肿瘤长大到约 50-80 mm 3吋 （大约 1周） 幵始进行治疗。 治疗 共分两组， 即载药纳米粒子 （PTX-HA-PLGA NPs) 和 PTX临床制剂 （Taxol) ， 用空纳米粒子 （HA-PLGA NPs) 和生理盐水 （PBS) 作为对照组。 将给药起始 曰定义第 0天， 分别在第 0、 3、 6、 9和 12天通过小鼠尾静脉注射给药 （PTX药量 为 5 mg/kg) 。 在治疗期间， 观察荷瘤小鼠的肿瘤体积、 体重变化和存活率。 小 鼠的体重是每三天称量一次。 小鼠的肿瘤体积用游标卡尺测量， 计算方法为： V = (LxWxH) 12, (其中 L为肿瘤的长度， W为肿瘤的宽度， H为肿瘤的厚度） 。 持续观察小鼠的生存到 38天。 实验过程中小鼠自然死亡或肿瘤体积大于 1000 mm³吋， 判定为死亡。 结果发现 PTX-HA-PLGA NPs和 Taxol都能在一定程度上抑 制肿瘤的生长， 而且 PTX-HA-PLGA NPs表现出了明显更优越的抑制肿瘤生长效 果， 在静脉注射载药纳米 21天后， 肿瘤仍能得到很好地抑制， 无明显增长。 体 重测试结果显示 PTX-HA-PLGA

NPs不会引起小鼠体重明显变化， 这证实了 PTX-HA-PLGA NPs不会产生明显的 毒副作用。 Kaplan-Meier生存曲线观察结果显示荷瘤老鼠经静脉注射 PTX-HA-PL GA NPs后， 在整个治疗周期没有出现死亡； 而 PBS组和空白纳米粒子组动物在 治疗 38天后全部死亡， Taxol组也有 60%的动物在治疗观察结束后死亡。 H&E染 色后的组织学分析表明 PTX-HA-PLGA NPs能诱导肿瘤细胞大面积坏死， 而对肝 脏、 肾脏等正常组织无明显毒性； 而 Taxol虽然能在一定程度上杀死肿瘤细胞， 但同吋也会导致正常组织 （肝脏和肾脏） 的损伤。 因此， 用本发明的高分子表 面活性剂制备的载药纳米粒子能将药物靶向输送到病灶部位， 实现明显增强的 疗效； 同吋还大大减小了小分子憎水药物的毒副作用。

综上可知， 本发明基于聚氨基酸的生物可降解性聚合物可以作为表面活性剂， 与 PLGA、 PLA、 PCL或 PEG-PLA等形成纳米粒子， 增加了聚合物的生物可降解 性以及功能性， 进一步的， 还可以加入靶向分子， 得到靶向纳米粒子， 用于药 物的载体， 不仅增加药物富集率， 提高药物靶向能力， 更解决了现有载体存在 的生物可降解性差、 有毒、 不稳定的缺陷。