COMPOSITION FOR ARTICULAR CAVITY INJECTION COMPRISING NUCLEIC ACID AND CHITOSAN

명세서

발명의명칭:핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물 기술분야

본발명은핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물에관한것이다. 배경기술

관절 (articulation)은뼈와뼈가연결되는부위로,관절을구성하는두뼈가 마주하는면에는관절연골이라고불리는유리연골의얇은층이 있다.관절 주위는골막의연속인결합조직성막으로둘러싸여져 있고이것을

관절낭이라고하며,그내강을관절강 (articular cavity)이라고한다.관절낭의 내면에는활막이라는얇은막이 있으며끊임없이소량와활액을관절강내에 분비하여관절운동을부드럽게한다.

이러한관절에문제가생기면관절질환이나타나는데，이증가장유병률이 높은질환이골관절염이다.골관절염이주로침범되는부위는손가락,무릎， 고관절및요추이며침범관절에따라조금씩다르지만통증과운동제한이 공통적인증상이다.골관절염의치료목표는통증을완화시키며,관절의 운동성을유지하고개선함으로써장애를최소화하는것이다 (이충기, 2000).

골관절염은만성질환으로,기대.수명의증가와함께장기간의치료를필요로 한다.치료와선택은크게비약물적보존적치료，약물요법및수술적치료로 크게나눌수있고,치료계획은증상의정도및기간,방사선학적소견，환자의 나이및동반질환,생.활양식및사회경제적수준，발병전활동도등에따라 개별적으로수립되어야한다 (Lee S.C., et al., 2010; Yoon J.P., et al., 2012).

골관절염은다른관절질환들과는다르게관절강내약물투:여가가능한ᅵ 질환이다.히알루른산 (hyaluronic_acid, HA)은다당류로서관절활액의중요한 구성성분중하나로히알루론산의존재는활액의 점탄성에기여하여활액이 윤활쎄와충격흡수제의 역할을할수있도록해준다 (Balazs E.A., et al, 1993). 이뿐만아니라고분자량의히알루론산은염증성관절에소염작용과진통작용을 가지고있다 (Kikuchi T., et al., 1996; Yoshimi T., et al., 1994; Sakakibara Y., et al., 1994).따라서현재골관절염치료를위해히알루론산의관절강내투여가여러 나라에서승인되어져사용되고있다. :

관절강내약물투여는적은양으로도_:적절한약물농도에도달시킬수있고 전신적부작용을최소화할수있다는장점아있다.하지만활액에서투여된 약물이머무르는시잔이 매우짧기때문에관절내에서지속적으로약물을 방출할수있는지속방출제형의개발이요구된다(06^^ ^， .， 2006).

[7] 이에，본발명자는관절강주사용조성물을연구하는과정에서 ,핵산및_{: :} 키토산을포함하는초성물을주입하여관절강의통증을완화시키고연골재생 효과를확인함으로써본발명을완성할수있었다. 종래선행기술로서 일본공개특허제 2010-531863호에는히알루론산및천연 유래의다른다당류일종이상을포함하는겔형태의관절강주사용물성제제를 기재하고있어본발명의구성과유사하나，핵산이 기재된바가없다.또한， 중국공개특허제 104546691호에는키토산을포함하는관절강주사용

은도감웅성 인 -시츄겔조상물을기재하고있어본발명의구성과유사하나， 핵산이기재된바가없어본발명의구성과차이가있다.한국공개실용신안 제 20-2009-0011604호에는히알루론산을포함하는관절강내주사를기재하고 있으나，핵산및키토산이기재되어 있지않아본발명의구성과차이가있다. 발명의상세한설명

기술적과제

본발명의목적은핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물을 ：

제공하는데있다.^:

[1이 또한，본발명의목적은핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물의 제조방법을제공하는데있다.

과제해결수단

본발명은핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물께관한것이다.

[12] 상기핵산은함량이조성물총중량을기준으로 0.1중량 %내지 3증량 %일수 있다.

상기키토산은함량이조성물총중량을기준으로 0.001중량 %내지

0.1중량%일수있다.

[14] 상기 핵산및키토산은 1:1내지 3000:1증량비율일수있다.

[15] 상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA),리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의흔합물일수있다.바람직하게는

디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA)이다.

[16] 상기디옥시리보핵산은올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide),

폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)및

폴리디옥시리보뉴클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide)에서선택될수있다.

상기 핵산은분자량이 IkDa내지 100,000kDa일수있다.바람직하게는 lOkDa 내지 10,000kDa이고,더욱바람직하게는 50kDa내지 3,500kDa이다.

상기키토산은분자량이 3kDa내지 l,000kDa일수있다.

상기조성물은수용성고분자를추가성분으로함유할수있다.

상기수용성고분자는히알루론산 (hyaluronic acid),콘드로이틴황산 (chondroitin sulfate),글리코겐 (glycogen),텍스트린 (dextrin),텍스트란 (dextran),덱스트란 황산 (dextran sulfate),히드록시프로필데틸샐를로스 (hydroxypropyl

methylcellulose),알긴산 (alginic acid),키틴 (chitin),풀루란 (pullulan),

콜라겐 (collagen),젤라틴 (gelatin)및이들의가수분해물，

폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol),폴리비닐피롤리돈 (poly vinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산 (polyacrylic add)및카르복시비닐중합체 (carboxylvinylpolymer)로 이루어진군중에서선택되는 1종이상일수있다.바람직하게는

히알루론산 (hyaluronic acid)이다.

[21] 상기조성물은은도에따라졸-겔전이가일어나는하이드로겔일수있다.

[22] 상기관절강주사는척추간판탈출증，오십견,어:깨관절층돌증후군,손목터널 증후군，변형성관절증，테니스 /골프엘보,복합적인부위별동통증후군,기타 건염및만성관절류머티즘으로이루어진군에서선택되는 1종이상의증상에 투여될수있다.

[23] 이하본발명을상세하게_.설명한다.

상기핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물은 i)핵산을

완충용액 (buffer)에넣고 40°C내지 70^oC에서교반하면서 30분내지 1시간동안 용해시켜 핵산저장용액을제조하는단계； ii)키토산을산성완층용액에 용해시켜키토산저장용액을제조하는단계; iii)상기 i)단계의핵산저장용액및 상기 ii)단계의키토산저장용액을핵산및키토산의중량비율이 1:1내지 3000: 1이되도록흔합하여 40°C내지 70°C에서 30분내지 1시간동안교반하는 단계;및 iv)상기 iii)단계의핵산-키토산흔합액을교반하면서상온으로낮추는 단계;를포함할수있다. ：

상기핵산저장용액제조시 이용할수있는완충용액으로는소듐포스페이트 디베이직：도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨 (sodium chloride),염화마그네슘 (magnesium chloride),

염화칼륨 (potassium chloride),인산완충식염수 (phosphate buffer saline)또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)완중용액이 있으며，바람직하게는소듐포스페이트디베이직도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)이며,가장바람직하게는 5~300mM의소듐 포스페이트디베이직도데카하이드레이트를이용할수있으나，이에한정하는 것은아니다.

상기키토산저장용액제조시 이용할수있는산성완충용액으로는

아세트산 (acetic acid),염산 (hydrochloric acid),아스코르브산 (ascorbic acid), 젖산 (lactic acid),질산 (nitric acid),글루탐산 (glutamic acid)또는포름산 (formic acid)이 있으며 ,바람직하게는아세트산 (acetic acid)이며，가장바람직하게는 10~300mM의아세트산을이용할수있으나，이에한정하는것은아니다.

상기 핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물은온도에따라졸-겔 전이가일어나는온도감웅성하이드로겔일수있다.

상기온도감웅성하이드로겔은온도에따라졸 (sol)이 겔 (gel)로또는겔이졸로 상전이 (phase transition)가일어나는것으로，졸이 겔로변하는현상을

겔화 (gelation)라고하며，본발명에서의 겔화는점탄성을가지며온도가 증가함에파라고분자가 3차원그물구조를형성하여용매에녹지않고 잔류하는상태가되는것으로정의한다. 상기온도감웅성하이드로겔성질을가지고있는관절강주사용조성물을 관절강내에주입하여체온에의해점탄성이회복되어 겔화시킴으로써관절강 내에상기조성물의분해속도를늦추고,잔류시간이증가되어,지속적인 윤활작용과층격흡수를통해관절을보호하고손상된연골조직수복효과를 증진시킬수있다.

상기 핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물은균일한 (homogeneous) 상태를유지하면서층분리가일어나지않는안정성 (stability)이높은것으로， 핵산및키토산은 1:1내지 3000: 1중량비율일수있다.바람직하게는 10: 1내지 300:1이다.더욱바람직하게는 10:1내지 100:1이다.

상기 핵산함량이조성물총중량을기준으로 0.1증량 %내지 3중량 %일수

있다.바람직하게는 1중량 <¾내지 2중량 %이다.

상기 핵산은분자량이 lOkDa내지 100,000kDa일수있고,바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고，가장바람직하게는 50kD내지 3,500kDa이다.핵산의 분자량이 lOkDa미만인경우에는겔의분해속도를조절하기가어려우며ᅳ

100,000kDa초과인경우에는겔의점성조절이어려워사용에문제가있다.

상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA),리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의흔합물일수있다.바람직하게는디옥시리보핵산이다.

또한，상기디옥시리보핵산은올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide),

폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)및

폴리디옥시리보뉴클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide)일수있다. ' 또한，상기키토산의함량은조성물의총중_:량을기준으로 0.0이중량 %내지

0.1증량%일수있고,바람직하게는 0.01중량^<¾내지 0.1증량%이다.

[36] 상기키토산은분자량이 3kDa내지 l,000kDa인것이바람직하나,이에

한정되지않는다.

상기 핵산및키토산의혼합은핵산및키토산의중량비율이 1:1내지 3000:1이 되도록혼합하며,이때,핵산의함량이조성물의총중량을기준으로 0.1중량 % 내지 3증량 %가되고，키토산의함량이조성물의총중량을기준으로 0.001중량^<¾ 내지 αι증량 %이되도록하는것이바람직하다.

상기 핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물은수용성고분자를

추가성분으로함유할수있다.

상기수용성고분자는핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물의

분해_.속도조절과윤활작용및치료효과를공고히：하기위해추가할수있다.

상기수용성고분자는생체내에서용해또는분해가능한것으로，

히알루론산 (hyaluronic acid),콘드로이틴황산 (chondroitin sulfate),

글리코겐 (glycogen),덱스트린 (dextrin),덱스트란 (dextran),덱스트란황산 (dextran sulfate),히드록시프로필메틸셀를로스 (hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산 (alginic acid),키틴 (chititi),풀루란 (pullulan)등의다당류나

콜라겐 (collagen),젤라틴 (gelatin)및이들의가수분해물등의단백질, 폴리비닐알코올 (poly vinyl alcohol),폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyn-olidone), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid),카르복시비닐중합체 (carboxylvinylpolymer)등의 합성고분자화합물을사용할수있으며,바람직한것은히알루론산이다.

상기수용성고분자를추가성분으로포함하는핵산및키토산을포함하는 관절강주사용조성물은핵산，키토산및수용성고분자가 1-3000： 1： 1-3000 중량비율로혼합된것일수있다.바람직하게는 10-1,000： 1： 10-1,000 중량비율이고，더바람직하게는 25-100 : 1 : 25~100중량비율이다.

상기히알루론산은선형또는가교된형태를포함하며 ,분자량이 20kDa내지 10,000kDa일수있으며， 500kDa내지 3,000kDa이바람직하나，이에 한정되지 않는다.

상기 핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물은관절강내주사를 통해관절강의통증을완화시키고,염증을감소시킬수있으며，연골재생을 유도할수있다.

상기 핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물은척추간판탈출증, 오십견,어깨관절충돌증후군，손목터널증후군，변형성관절증,테니스 /골프 엘보,복합적인부위별동통증후군,기타건염및만성관절류머티즘으로 이루어진군에서선택되는 1종이상와증상에투여될수있다.

발명의효과

본.발명은핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물에관한것으로, 보다자세하게는핵산및키토산의혼합을통해제조된관절강주사용조성물이 생체적합적이며,은도에따라졸-겔전이가일어나는것을확인하였다.또한，본 발명의조성물주입에따라연골조직의프로테오글리칸생합성이증가되어 연골조직의수복이나타나고,통증의감소로인해관절의운동성과관련되어 있는보행속도및보폭이향상된것을확인하였다.

따라서 ,본발명의관절강주사용조성물은통증완화및치료가필요한관절강 내주입이가능하고,주입된관절강내에서 겔화를통해조성물의분해속도를 늦추고，약물의체류시간아증가함에따라지속적인윤활작용과층격완화로 관절강의연골조직수복효과가층분히발휘될수있어뛰어난치료효과를 얻올수있을것으로기대된다.

도면의간단한설명

도 1은본발명의관절강주사용조성물의물성상태를확인한결과이다. 각각의관절강주사용조성물을제조한후 3일동안방치한후，조성물의 투명도와침전물생성및층분리여부를확인하였다.

도 2는본발명의실시예 1-1의관절강주사용조성물의온도에따른졸-겔 전이가일어나는하이드로겔형성을확인한결과를보여주고있다.:

도 3은관절강주사용조성물투여에의한염증반웅유도여부를통해

생체적합성을확인한결과를보여주고있다. 도 4는관절염유발후,본발명의관절강주사용조성물 (실시예 1-1，실시예 2-1 및실시예 2-7)주입에따른쥐의보행속도 (도 4A)및보폭 (도 4B)을확인한 결과를보여주고있다.

[51] 도 5는관절염유발후,본발명의관절강주사용조성물 (실시예 1-1및실시예

2-1)주입에따른프로테오글리칸의생합성정도를확인한결과를보여주고 있다.

발명의실시를위한최선의형태

이하본발명의바람직한실시예를상세히설명하기로한다.그러나，본발명은 여기서설명되는실시예에 한정되지않고다른형태로구체화될수도있다. 오하려,여기서：소개되는내용이철저하고완전해지고,당업자에게본발명의 사상을층분히전달하기위해제공하는것이다.

<실시예 1.핵산및키토산을포함하는관절강주사용조성물제조 >

핵산저장용액 (stock solution)의경우핵산을 190mM소듐포스페이트디베이직 도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완층용액에 넣고 70°C의 열교반기를이용하여 30분이상용해하여제조하였다

키토산저장용액은: lOOmM아세트산 (acetic acid)을이용하여제조하였다.

제조한핵산및키토산저장용액을흔합하여 70^oC의열교반기에서 30분동안 교반하였다.그후온도를상온으로낮추며 1시간동안교반하여 핵산및 키토산을포함하는관절강주사용조성물을제조하였다.이때，핵산및키토산의 농도가하기표 1의농도가되도록흔합하였다.

[표 1]

<실시예 2.핵산,키토산및히알루론산을포함하는관절강주사용조성물

제≤>

핵산저장용액의경우핵산을 190mM소듬포스페이트디베이직

도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완충용액에 넣고 70°C의 열교반기를이용하여 30분이상용해하여제조하였다.

키토산저장용액은: lOOmM아세트산 (acetic acid)을이용하여제조하였다.

제조한핵산및키토산저장용액을흔합하여 70^oC의열교반기에서 30분간 교반하였다.핵산및키토산흔합용액에히알루론산원료를추가흔합하여

60°C의 열교반기에서 1시간교반후, 3시간동안상온에서교반하여 핵산,키토산 및히알루론산을포함하는관절강주사용조성물을제조하였다.이때,핵산， 키토산및히알루론산의농도가하기표 2의농도가되도록흔합하였다.

[표 2]

상기히알루론산은분자량이 l,000kDa인것을사용하였으나,분자량이 20kDa 내지 10,000kDa인것을사용해도무방하다.

[64] <비교예 1.비교대상의관절강주사용조성물제조> ：

[65] 하기표 3에해당되는성분및함량에해당되는흔합비율에따라비교대상의 관절강주사용조성물을제조하였다.제조방법은상기실시예 1및실시예 2와 동알한방법을이용하였다. ·

[66] [표 3]

<실험예 1.관절강주사용조성물의물성확인： > :

상기실시예 1(실시예 1-1내지실시예 1-5)，실시예 2(실시예 2-1내지실시예 2-9)및비교예 1(비교예 1-1내지비교예 1-14)의관절강주사용조성물올 이용하여 겔화，겔의한정성및용해성 여부를확인하였다.

각각의조성물을흔합하고 3일동안방치한후투명도와겔화상태를육안으로 관찰하였고,겔화정도는레오미터를이용하여 24⁰C부터 40^oC까지 1⁰C씩 올려주면서 1분간유지시켜점탄성측정값의증가변화로확인하였으며,겔의 안정성은침전물생성및층.분리껴부로확인하였다.겔의용해성여부는 37.5 의수용액에실시예 1,실시예 2및비교예 1의관절강주사용조성물을 점적하여 겔화시킨후온도를 37.5°C로유자하면서, 400rpm으로 5분동안 교반하면서 겔의용해여부를확인하였고，그결과를표 4및도 1에나타내었다. [표 4]

구성 3일경과후결과 3그 5⁰C에서 5분 동안교반결과 ᄇ

점타성 침전물생성 i 겔의용해 실시예 1-1 0 X X X

실시예 1-2 ο X X X

실시예 1-3 ο X X X

실시예 1-4 ο ᅳ X X X

실시예 1-5 0 X X X

실시예 2-1 ο X X X

실시예 2-2 ο X X X

실시예 2-3 0 X X X

실시예 2-4 ο X X X

실시예 2-5 ο X X X

실시예 2-6 ο X X X

실시예 2-7 ο X X X

실시예 2-8 ο X X X

실시예 2-9 ο X X X

비교예 1-1 ο X X o

비교예 1-2 X X X o

비교예 1-3 ο ο ο O

비교예 1-4 ο X X O

비교예 1-5 ο X X 0

비교예 1-6 X 0 X 0

비교예 1-7 X X X 0

비교예 1-8 X： X X O

비교예 1-9 ο Ο X O

비교예 1-10 0 X X 0

비 Ιϋ예 1-11 X . . · Ο X X

비교예 1-12 X 0 X X

비교예 1-13 0 Ο . ο 0 비교예 1-14 o o o o

상기표 4및도 1을살펴보면，실시예 1및실시예 2의관절강주사용조성물의 경우에는 3일이경과하여도침전물생성및층분리현상이나타나지

않으면서도점탄성을유지하고있는것을알수있으며,겔의용해성의경우 37.5⁰C에서 겔을형성하고，형성된겔이지속적으로유지되는것을관찰하였다.

그러나，비교예 1의 비교대상의관절강주사용조성물의 경우에는침전물이 생성되거나，층분리가일어나거나부분적으로덩어리가생성되어 점탄성의 측정이불가능하였으며_>겔의용해성의 경우 3그 5°C에서 겔화되지않거나 겔화가되더라도 5분이내에모두용해되는것으로확인되었다.특히나，비교예 1-13및비교예 1-14의관절강주사용조성물과같이핵산이포함되지않은 경우에는조성물이 점탄성을가지지만침전물생성및층분리현상이나타나며 37.5°C에서 겔이형성된후 5분이내에모두용해되어안정성이떨어지는것을 확인하였다 (표⁴참조).

이를통해，본발명의관절강주사용조성물은온도변화에따라은도감웅성을 나타내고,겔화된후에도겔의 ¾태를지속적으로유지한다는것을알수 있었으며,이에따라，주입된본발명의조성물이관절강내에서 겔화되어 점성과탄성이회복되어지속적인윤활작용과함께층격을흡수함으로써 관절을보호할수있고，약물체류성이증가되어손상된연골조직의수복효과를 증대시킴으로써우수한관절염치료효과를나타낼수있음을예상할수있다.

<실험예 2.온도에따른졸-겔전이 (sol-gel transition)확인 >

상기실시예 1，실시예 2및비교예 1의관절강주사용조성물의온도변화에_. 따른졸-겔전이가일어나는하이드로겔형성을확인하였다.

졸-겔전이를확인하기위해서 레오미터 (rheometer)를이용하였다.이때사용한 측정조건은 PU20,간격 (Gap) 0.5mm, 0.1Hz, 1%웅력-변형률 (stress strain)로

24⁰C부터 40°C까지 1°C씩올려주면서 1분간유지시켜 G' (탄성)및 G" (점성)의 변화를측정하였다.또한,각각의조성물에온도를가하여 36⁰C전ᅳ후꾀졸-겔 상변화를육안으로관찰하여도 2에나타내었다.

도 2에서보여주듯이,실시예 1-1의관절강주사용조성물이 36⁰C미만의

은도에서는졸의형태를띠는반면에 36 가.넘으면겔화되는것을관찰하였다. 이러한결과는실시예 1및실시예 2와관절강주사용조성물모두에서동일하게 나타나는것을확인하였다.

이를통해본발명의관절강주사.용조성물이온도에따라졸-겔전이가

일어나는온도감웅성하이드로겔성질을나타낸다는것을알수있었다. ：

[79] <실험예 3.실험동물의준비>

동물실험은 7주령의 Sprague-Dawley계수¾쥐 (Rat)를영바이오 (성남시，

대한민국)로부터구입하여사용하였다.사료는실험동물용고형사료 (Harlan laboratories, Inc.,: USA)를사용하였고급이기에고형사료를넣어자유섭취 시켰다.음수는수듯물을필터유수살균기로여과한후자외선을조사하였고, 자동급수장치로자유섭취시켰다.실험동물사육실의환경은온도 23±3°C, 상대습도 55±15%,조명시간 12시간 (오전 8시 점둥 -오후 8시소등)및조도 150~300Lux로유지하였다.

<실험예 4.관절강주사용조성물의생체적합성확인 >

상기실험예 3의쥐를이소플루란 (Isoflurane)을이용하여호흡마취시켰다. 마취한쥐의오른쪽무릎부위의털을깎고베타딘솜으로주사부위를소독한 다을멸균된 lcc의인슐린주사기와 30게이지 (gauge)의바늘을이용하여상기 실시예 1-1및실시예 2-1의관절강주사용조성물 O.O^cc를오른쪽무릎에 주사하였고，대조군으로서식염수 (Saline)를동일한방법으로주사하였다.

관절강주사용조성물주입후 0₂가스로쥐를회생시킨후,오른쪽무릎

조직을잘라포르말린으로고정하였고，일련의탈수작업을거쳐파라핀에심어 파라핀블록을제작하였다.이때，정상군으로아무것도처리하지않은쥐의왼쪽 무릎의조직도함께파라핀블록을제작하였다.제작한파라핀블록을 5^: 두께로조직절편하고,조직절편을 Mayer's hematoxyline(Sigma, USA)용액에 1초간반응시킨후，흐르는물에서 10분간세척하였다.이후 eosin(Si_gma, USA) 용액에 3초간반웅시켰다.염색이완료된조직은탈수과정을거쳐 Permount^® (Fischer scientific, US A)로봉입하였다. H&E염색한조직절편을현미경을： 이용하여조직병리학적 변화의유무를관찰함으로써 생체적합성을확인하였고， 그결과를도 3에나타내었다.

도 3에서보여주듯이， H&E로염색늉조직절편을살펴보면，실시예 1-1및

실시예 2-1의관절강주사용조성물을주입한경우에식염수를주입한대조군및 아무것도처리하지않은정상군과동일하게염증반웅이나타나지않았다.

이를통해，본_.:발명의관절강주사용조성물이조직에서의면역반웅이나

염증을일으키지않는생체적합적인조성물임을확인하였다._.

<실험예 5.관절강주사용조성물의통증완화효과확인 >

상기실험예 3의쥐를이소플루란 (Isoflurane)을이용하여호흡마취시켰다. 마취한쥐의오른쪽무릎부위의털을깎고베타딘:솜으로주사부위를소독한 다음멸균된 lcc의 인술린주사기와 30게이지 (gauge)의바늘을이용하여 0.9% 염화나트륨 (sodium chloride, NaCl)에회석한 MIA(modosodium iodoacetate) lmg/50 i£를관절강내주사요법 (intra-articular injection)을통해무릎에 1회_, 주입한후 1주일동안사육하여관절염을유발하였다ᅳ

관절염을유도시킨쥐를이소플루란 (Isoflurane)을이용하여호흡마취시켰다. 마취한쥐의오튼쪽무릎부위의털을깎고베타딘；솜으로주사부위를소독한 다음멸균된 lcc의 인슐린주사기와 30게이지 (gauge)의바늘을이용하여상기 실시예 1,실시예 2및비교예 1의관절강주사용조성물을주 1회,총 4번을 주사하였다.조성물은 1회에 0.05cc씩주사하였다.이때,대조군으로서식염수를 오른쪽무릎에주사하였고，정상군으로서관절염을유도하지않은쥐를 이용하였다.

통증완화효과는관절강주사용조성물을 4회주입후,쥐가플라스틱

케이지 (150cmxl3cmxl6cm)를통과할때,케이지바닥면을비디오카메라를통해 촬영하여쥐의움직임을관찰하고，쥐의발바닥을인식하는프로그램을통해 촬영한영상을이용하여쥐의보행속도와보폭을분석함으로써확인하였다.그 결과를도 4에나타내었다.

도 4의쥐의보행속도 (도 4A)및보폭 (도 4B)을확인한결과에서보여주듯이， 식염수를주사한대조군의경우,정상군에비해쥐의보행속도및보폭이 감소된반면에，실시예 1-1,실시예 2-1및실시예 2-7의관절강주사용조성물을 주사한경우에관절염에의해감소된보행속도및보폭이희복되어정상군과 비슷한것으로나타났다.이는실시예 1및실시예 2의관절강주사용조성물 모두에서비슷한효과가나타나는것을확인하였다.그러나,도 4에표기한 비교예 1-1,비교예 1-3，비교예 1-4및비교예 1-12의관절강주사용：조성물을 비롯한나머지비교예 1의조성물에서쥐의보행속도맟보폭이 대조군과 비슷한것으로나타났다. ：

이는，관절강내에주사된본원발명의관절강주사용조성물에의해관절염이 치료됨으로써관절염에의한통증이완화되어쥐의보행속도및보폭이증가된 것으로사료된다.또한，본원발명의관절강주사용조성물은온도감웅성을갖고 있으며,체온에의해겔화되어점탄성을갖는특성으로인해관절의윗뼈와 ： 아랫뼈간의마찰을즐이고,층격을흡수함으로써통증을완화시키는효과를 증가시키는것으로예측된다.

<실험예 6.관절강주사용조성물의 연골재생효과확인 >

실험예 6-1.관절염동물모델제조및조성물주입

상기실험예 3의쥐를이소플루란 (Isoflurane)을이용하여호흡마취시켰다. 마취.한쥐의오른쪽무릎부위의털을깎고베타딘솜으로주사부위를소독한 다음멸균된 lcc의 인술린주사기와 30게이지 (gauge)의바늘을이용하여 0.9% 염화나트륨 (sodium chloride, NaCl)에희석한 MIA(modosodium iodoacetate) lmg/50/i£를관절강내주사요법 (intra-articular injection)을통해무릎에 1회주입한 후，관절염이유발되도록 1주일동안사육하였다.관절염의유도가성공적으로 이루어졌음은쥐의보행속도저하와보폭이감소된것으로확인하였다.

관절염이유도된쥐의오른쪽무릎에상기실시예 1,실시예 2，및비교예 1의 관절강주사용조성물및대조군인식염수 (saline)를주사한후케이지안에 넣고 안정한환경속에서사육하였다.이때,관절강주사용조성물및식염수는 ().05cc씩 1주일 다 1회씩총 4회주사하였다.

실험예 6-2.관절강주사용조성물의 연골재생효과확인

상기실험예 6-1에서본발명의관절강주사용조성물을 4회주입한후， C0₂ 가스로쥐를희생시키고，각실험군에대해아무것도처리하지않은왼쪽무릎 조직. (정상)과비교예및실:시예의 약물을주사한오른쪽무릎의 양쪽무릎연골 조직을잘라연골재생효과를확인하였다.

연골재생효과는프로테오글리칸 (proteoglycan)염색을통해확인하였다. 프로테오글리칸은연골아세포증식에관여하는물질로연골아세포의증식은^' 연골생성에필수적인과정중하나이다.

무릎연골조직을포르말린으로고정하고일련와탈수작업을거쳐파라핀에 심어파라핀블록을제작하였다.제작한파라:핀블록을 두께로조직 . 절편하고，프로테오글리칸 (proteoglycan)을사프라닌 0(Safranin 0)염색방법을 이용하여염색하고,프로테오글리칸의양을비교하였다.이때정상군으로 관절염을유도하지않은쥐의왼쪽무릎조직을이용하였고，대조군으로^' 관절염을유도시킨후식염수를처리한쥐의무릎조직을이용하였다.

프로테오글리칸의 양은정상군조직의프로테오글리칸양을 100%기준으로 하여상대적인염색면적비율로계산하였고,그결과를도 5및표 5에 나타내었다.

[표 5]

도 5에서보여주듯이，사프라닌 0염색에의해붉은색으로염색된연골표면의 프로테오글리칸 (화살표로표시)을살펴보면，대조군의 경우,정상군과대비하여 연골표면에붉은색으로염색된부분이감소된것을통해관절염유발에의해 프로테오글리칸의 양이감소된것을알수있다.이에반해，실시예 1-1및실시예 2-1의관절강주사용조성물을주사한경우에는대조군에비해연골표면의 프로테오글리칸의 양이증가되아붉은색으로염색된부분이증가한것을 . 확인하였다.

상기표 5의프로테오글리칸와상대적인염색면적비율을계산한결과를

살펴보면,정상군에비해대조군의수치가 42%로나타나는반면에 실시예 1-1， 실시예 1-3.실시예 1-4및심시예 2-1의관절강주사용조성물을주사한 경우에는 80%이상의수치를나타내고있다.그러나비교예 1-1，비교예 1-2， 비교예 1-5및비교예 1-10의관절강주사용조성물을주사한경우에는실시예 1 및실시예 2의관절강주사용조성물을주사한경우보다그수치가낮은것을알 수있다.

이를통해，본원발명의실시예 1및실시예 2의관절강주사용조성물의관절강 내주사에의해관절염이유도된관절강내의 연골에서프로테오글리칸의 발현이증가됨으로써연골재생수복이 일어남을알수있습니다.