ПОЛИПЕПТИД АНТИ-ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИТЕЛА, ЕГО ГЕН И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Область техники

Изобретение относится к использованию биотехнологии в защите окружающей среды, в частности к полипептиду анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, его гену и способу его получения.

Известный уровень техники

Размножение цианобактерий и загрязнение воды, вызываемое эвтрофикацией воды, наносит наибольший вред водной среде во всем мире, приводя к большим экономическим убыткам и непоправимому ущербу биосфере Земли. Вместе с ускоренной индустриализацией и урбанизацией в результате экономического развития Китая загрязнение и деградация окружающей среды приобретают все более и более серьезный характер, и биономический контроль водной окружающей среды стал критической проблемой, требующей внимания и решения.

Современные антибактериальные агенты являются практически неэффективными против цианобактерий - прокариот (prokaryocyte), принадлежащих к типу (Phylum) X цианобактерий, домен Бактерии. В настоящее время существуют только химические реагенты на основе тяжелых металлов, например сульфат меди и т.д., позволяющие бороться с цианобактериями. Однако при практическом использовании против цианобактерий передозировка и повторное использование препаратов вследствие их ограниченного эффекта уничтожает другие полезные водоросли, водные растения, организмы и вызывает необратимое и постоянное разрушение окружающей среды, а также увеличение содержания остатков агента на основе тяжелого металла как в окружающей среде, так и в сельскохозяйственных продуктах. Поэтому существует большая потребность в разработке высокоэффективных и безопасных анти-цианобактериальных препаратов.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гены, рекомбинантные плазмиды и полипептиды нового полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела; указанные полипептиды способны специфически уничтожать клетки цианобактерий без повреждения других клеток водорослей, растений и животных. Другой аспект настоящего изобретения заключается в создании способов получения указанных полипептидов анти-цианобактериального рекомбинантного антитела.

Предусматривается гибридома с депозитарным номером CGMCC (Китайский центр общей коллекции микробиологических культур, China General Microbiological Culture Collection Center) 4783.

Также предусматривается моноклональное антитело, секретируемое указанной гибридомой.

Также предусматриваются полипептид мимика антитела с функцией распознавания и связывания цианобактерий, представляющий собой антигенсвязывающий фрагмент указанного моноклонального антитела, или малый молекулярный полипептид, сконструированный на основе функциональных участков указанного антигенсвязывающего фрагмента указанного моноклонального антитела.

Указанный полипептид мимика антитела, его аминокислотная последовательность приведена в SEQ ID NO. 3.

Также предусматривается ген, кодирующий любой из указанных полипептидов мимиков антител.

Указанный ген имеет нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 2.

Также предусматривается полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, сконструированный путем функционального и линейного соединения указанного полипептида мимика антитела, способного распознавать и связывать цианобактерии с С-концом полипептида колицина, и указанный колицин выбирают из колицина Е1, Ia, Ib, A, В или N.

Указанный полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 7.

Также предусматривается ген, кодирующий любой из указанных полипептидов анти-цианобактериального рекомбинантного антитела.

Указанный ген имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO. 6.

Также предусматривается рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий ген, кодирующий указанный полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела.

Также предусматривается способ получения указанного анти-цианобактериального рекомбинантного полипептида со следующими стадиями: трансдукции гена, кодирующего полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, в систему экспрессии Е. coli, культивации подвергнутого трансдукции E. coli и выделения полипептида, экспрессируемого Е. coli.

Также предусматривается использование указанного полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела для контроль эвтрофикации воды.

Изобретение предусматривает полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, сконструированный из полипептида колицина и полипептида мимика антитела против антигена клеточной поверхности цианобактерии. В указанной молекуле полипептида, миметики антитела против антигена клеточной поверхности цианобактерии распознают и связываются с цианобактериями, в результате чего колицин молекулы атакует распознанную клетку цианобактерии. При специфическом распознавании миметиком антитела антигена клеточной поверхности цианобактерии полипептид по изобретению атакует клетки цианобактерий без вреда для других водных организмов и без загрязнения воды, тем самым обеспечивая защиту окружающей среды и безопасную борьбу с загрязнением воды цианобактериями. Миметик антитела в полипептиде анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по изобретению представляет собой миметик антитела, способный распознавать цианобактерии и связываться с ними и сконструирован на основе аминокислотных последовательностей и нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепей антигенсвязывающего фрагмента (Fab) моноклонального антитела, секретируемого гибридомой CGMCC No. 4783, такой как антитела-мимики, хорошо известны специалистам, например одноцепочечное антитело и миметики антитела, представляющие собой малые молекулы и т.д. В соответствии с изобретением сконструированные миметики антитела должны только быть способны распознавать антиген, поскольку единственная задача миметиков антитела заключается в нацеливании рекомбинантной молекулы полипептида на клеточную поверхность мишени и создании ионного туннеля в клеточной оболочке колицином рекомбинантного полипептида, что приводит к гибели клетки-мишени вследствие вытекания внутриклеточного вещества. Таким образом, любые рекомбинантные полипептиды, сконструированные путем присоединения колицина к миметику антитела, который сконструирован на основе указанного моноклонального антитела и может распознавать антиген-мишень, будут входить в объем заявляемого изобретения.

В варианте исполнения изобретения миметик антитела представляет собой 28-пептидные миметики антитела, сконструированные путем сцепления доменов V_HCDR1, V_HFR2 и V_LCDR3 моноклонального антитела против поверхностного антигена протопласта цианобактерий (секретируемого гибридомой CGMCC No. 4783) в порядке V_HCDR1-V_HFR2-V_LCDR3. Эксперименты внутри и вне помещений показали, что анти-цианобактериальный полипептид, сконструированный указанными миметиками антителами, обладает биологической активностью, позволяющей ему перемещаться и автоматически искать антиген клеточной поверхности цианобактерий в воде. Пептидные миметики антитела имеют те преимущества, что их легко клонировать, экспрессировать, и обладают способностью распознавать исходное антитело; они могут уничтожать цианобактерии путем нацеливания колицина рекомбинантного полипептида на мембрану клетки-мишени для создания ионного туннеля. Указанный рекомбинантный полипептид имеет большую экологическую безопасность и безвредность для окружающей среды по сравнению с современными препаратами для борьбы с загрязнением воды (например, сульфатом меди).

В соответствии с изобретением колицин для конструирования полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела может быть выбран из колицинов Е1, Ia, Ib, А, В или N, которые могут формировать ионный канал. Рекомбинантный полипептид, сконструированный из анти-цианобактериальных миметиков антитела и колицина Ia, тестируют в примерах изобретения. Однако, обладая способностью к образованию ионного канала в клеточной оболочке цианобактерий, любой из этих колицинов, соответствующих идее изобретения, может быть линейно присоединен к анти-цианобактериальным миметикам антитела для конструирования рекомбинантного полипептида для осуществления изобретения, то есть для получения рекомбинантных полипептидов, уничтожающих цианобактерии.

Изобретение также предусматривает способ получения рекомбинантной плазмиды, содержащей ген рекомбинантного полипептида, где нуклеотидная последовательность, кодирующая миметики антитела, вставляется в С-конец колицина путем сайт-направленного мутагенеза двухцепочечных олигонуклеотидов, с образованием рекомбинантной плазмиды по изобретению. Если взять колицин Ia в качестве примера, рекомбинантная плазмида по изобретению конструируется путем вставки нуклеотидной последовательности, кодирующей миметики антитела, в сайт после аминокислоты 626 гена колицина Ia (С-конец). Исходный вектор pSELECT-1, который был приобретен у фирмы Promega Corp., содержит гены колицина Ia и иммунный белок. В Примере 1 настоящего изобретение были сконструированы несколько пар праймерных последовательностей для генов миметиков антитела. Рекомбинантную плазмиду, например pCHCcyanoMA1, готовят в соответствии с инструкцией к набору фирмы Strategene Corp. путем сайт-направленного мутагенеза двухцепочечных олигонуклеотидов.

В другом аспект изобретения, предусматривается способ получения указанного анти-цианобактериального полипептида по изобретению, где рекомбинантную плазмиду, содержащую ген, кодирующий полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, получают путем функционального сцепления гена, кодирующего миметики антитела, с геном колицина и полученную рекомбинантную плазмиду трансфицируют в подвергаемые генетическому модицированию бактерии Е. coli для получения генно-модифицированных бактериальных клеток, которые могут продуцировать полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела. Указанный анти-цианобактериальный полипептид по изобретению затем получают в результате разделения и очистки с помощью ионообменной колонки.

Указанный анти-цианобактериальный полипептид по изобретению может быть использован для борьбы с загрязнением воды. Экологически пригодные комбинации препаратов могут быть приготовлены путем прибавления векторов, эксципиентов или других альтернативных компонентов в полипептид по изобретению по следующему механизму: миметики антитела в полипептиде, которые распознают антиген клеточной поверхности цианобактерии, нацеливают колицин на клеточную оболочку цианобактерий со вставкой в нее гидрофобного фрагмента домена ионного канала колицина, с образованием ионного канала, что вызывает гибель клетки цианобактерии вследствии вытекания внутриклеточного вещества.

Указанный анти-цианобактериальный полипептид по изобретению обладает преимуществом специфичности по отношению к мишени по сравнению с традиционными анти-цианобактериальными препаратами, таким образом, он не атакует другие водорослевые, растительные и животные клетки; токсичностью и нежелательными эффектами зничительно более низкими, чем у традиционных анти-цианобактериальных препаратов. Кроме того, поскольку ионный канал формируется непосредственно в клеточной оболочке цианобактерий, приводя к гибели клеток цианобактерий, клеткам цианобактерий трудно починить геометрические повреждения клеточной оболочки путем генной мутации и экспрессии белка за короткое время, в течение которого внутриклеточное вещество вытекает через ионный канал анти-цианобактериального полипептида, вызывая гибель клетки цианобактерии. Таким образом, существует низкая вероятность того, что клетки цианобактерий выработают резистентность к препарату анти-цианобактериального полипептида по изобретению, что указывает на перспективность применения указанного анти-цианобактериального полипептида по изобретению.

Информация о депонировании гибридомы:

Номер депонирования: CGMCC No. 4783

Название при депонировании: Гибридома моноклонального антитела против антигена клеточной поверхности цианобактерий

Дата депонирования: 4 апреля 2011 г.

Депозитарная организация: Китайский центр общей коллекции микробиологических культур (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)

Адрес: No. 3, Courtyard No. 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing

Описание чертежей

Фиг. 1 - схематическое изображение структуры рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA1, содержащей гены миметиков антитела и колицина Ia.

Фиг. 2 - схематическое изображение структуры анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по настоящему изобретению.

Фиг. 3 - схематическое изображение структуры рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA2, содержащей гены миметиков антитела и колицина Ia с частично обратным порядком в направлении N-C.

Фиг. 4 - результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом по изобретению Microcystis aeruginosa, культивируемых в жидкой среде,

где А - холостой контрольный опыт; В - 50 мкг/мл ампициллина; С - 50 мкг/мл феромона широкого спектра действия (Ph-NM); D - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); Е - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (2).

Фиг. 5 - экспериментальные результаты по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом (1) по изобретению Microcystis aeruginosa, культивируемых в жидкой среде,

где А - результаты обработки в течение 48 часов; В - результаты обработки в течение 72 часов; С - результаты обработки в теченеие 96 часов,

где в каждом ряду (колонка), слева направо 6 колб в следующем порядке: 1 - контроль; 2 - 0,1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 3 - 0,5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 4 - 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 5 - 5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 6 - 10 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1).

Фиг. 6 - результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом (1) по изобретению Scenedesmus, культивируемых в жидкой среде.

где в каждом ряду по 6 колб, которые подвергают обработке в течение 10 дней, слева направо, в следующем порядке: 1 - контроль; 2 - 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 3 - 5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 4 - 10 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 5 - 15 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 6 - 20 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1).

Фиг. 7 - результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом (1) по изобретению Microcystis aeruginosa и Scenedesmus, культивируемых в жидкой среде. Результаты для Microcystis aeruginosa представлены в верхней части, а для Scenedesmus - в нижней части.

Фиг. 8 результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом по изобретению Microcystis aeruginosa, Anabaena, Chlorella и Scenedesmus, культивируемых в жидкой среде,

где левая колба предоставляет собой контроль, а правая - 35 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1). A: Microcystis aeruginosa; В: Anabaena; С: Chlorella; D: Scenedesmus.

Фиг. 9 - результат эксперимента по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом по изобретению для природной воды, загрязненной цианобактериями,

где А - холостой контрольный опыт; В - 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); С - 5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); D - 10 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); Е - 0,7 мкг/мл сульфата меди.

Фиг. 10 - некоторые результаты эксперимента по ингибированию, приведенного на Фиг. 9,

где А - изменения оптической плотности воды; В - изменения хлорофилла А в воде; С - изменения рН воды; D - изменения популяции доминирующих водорослей в воде, где D-1 - контрольная группа; D-2 - группа, обработанная 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); D-3 - группа, обработанная 0,7 мкг/мл сульфата меди.

Фиг. 11 - исследования под микроскопом (400-кратное увеличение) ингибирования анти-цианобактериальным полипептидом природной воды, загрязненной цианобактериями, на Фиг. 9,

где представлены изменения водорослей (Anabaena), обработанных контролем, 1 мкг/мл анти-цианобактериальным полипептидом (1) и 0,7 мкг/мл сульфата меди в воде в первый день (А), на второй день (В), на третий день (С), на четвертый день (D) и на пятый день (Е), соответственно.

Детальное описание

Пример 1. Конструирование плазмиды, экспрессирующей анти-цианобактериальный полипептид, и получение анти-цианобактериального рекомбинантного полипептида

Материал: Гибридома CGMCC No. 4783.

Стадия 1. Получение нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности миметиков антитела: моноклональное антитело, секретируемое гибридомой, собирают и секвенируют с использованием обычных способов для получения последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи антигенсвязывающего фрагмента Fab; аминокислотная последовательность миметиков антитела была сконструирована на основе аминокислотной последовательности участков, определяющих комплементарность, как представлено в SEQ ID NO. 3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая указанные миметики антитела, приведена в SEQ ID NO. 2.

Стадия 2. Исходный вектор представляет собой плазмиду pSELECT-1 (приобретена у фирмы Promega Corp.), которая нессет гены колицина Ia и иммунный белок (указанные гены были загружены в лаборатории, где проводились эксперименты данного изобретения). Ген, кодирующий миметики анти-цианобактериального антитела (нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO. 2 в перечне последовательностей), был вставлен после сайта I626 гена колицина Ia с использованием технологии сайт-направленного мутагенеза двухцепочечного олигонуклеотида (набор QuickChange™, Strategene Corp.) с получением рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA1 (представленной на Фиг. 1). Рекомбинантную плазмиду затем трансфицировали в генно-модифицированные бактерии Е. coli В834 (DE3) для получения полипептида. Был получен указанный анти-цианобактериальный полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 7 (тут и далее называемый "анти-цианобактериальный полипептид (1)") и молекулярным весом примерно 70000.

Прооцесс сайт-направленного мутагенеза двухцепочечного олигонуклеотида проводили в соответствии с руководством к набору для сайт-направленного мутагенеза Strategene QuickChange (№ по каталогу 200518).

1. Приготовление реагентов для сайт-направленного мутагенеза:

5 мкл 10× буфера,

2 мкл (10 нг) плазмиды колицина Ia дикого типа,

1 мкл (125 нг) 5′-3′ сконструированных олигонуклеотидных праймеров,

1 мкл (125 нг) 5′-3′ сконструированных олигонуклеотидных праймеров,

1 мкл dNTP,

Бидистиллированная вода, 50 мкл,

1 мкл pfu (бляшкообразующая единица)

(все компоненты входят в состав набора, за исключением плазмиды, праймеров и бидистиллированной воды).

2. ПЦР-амплификация, условия амплификации: 20 циклов денатурации при 95°С в течение 35 секунд, отжиг при 53°С в течение 70 секунд и удлинение при 68°С в течение 17 минут.

3. 1 мкл эндонуклеазы Dpn 1 прибавляют к гидролизованной ДНК-цепи (37°С, 1 час); 1 мкл реагента и 50 мкл HMS174 компетентных клеток инкубируют вместе на льду в течение 30 минут и затем инкубируют на льду в течение 2 минут после теплового шока при 42°С в течение 45 секунд.

4. Прибавляют 0,5 мл культуральной среды NZY и культивируют со встряхиванием при 37°С, 220 об/мин в течение 1 часа. Наносят 50-100 мкл реагента на пластинку среды LB плюс 1% агара и 50 мкг/мл ампициллина для культивации в течение ночи при 37°С.

5. Колонии собирают после культивации в течение 18 часов. Плазмиду экстрагируют с использованием набора для экстракции фирмы Qiagene Corp. или Gibco Corp. и затем секвенируют для подтверждения успешности мутации.

6. Инкубируют 50 нг рекомбинантной плазмиды с 50 мкл приготовленных компетентных клеток Е. coli B834 (DE3) на льду в течение 30 минут и подвергают действию теплового шока при 42°С в течение 30 секунд. Прибавляют 50-100 мкл реагента с 0,5 мл культуральной среды SOC, культивируют со встряхиванием при 37°С, 220 об/мин в течение 1 часа и наносят на пластинку среды LB плюс 1% агара и 50 мкг/мл ампициллина для инкубации при 37°С в течение 12-16 часов. После этого выбирают отдельную колонию.

7. Бактерии амплифицируют в 8-16 литрах среды LB при 250 об/мин, 37°С в течение 6-8 часов. Бактерий осаждают центрифугированием при 6000×g, 4°С в течение 20 минут, ресуспендируют с 50-80 мл 50 мМ бората, 2 мМ ЭДТА (рН 9,0) при 4°С; прибавляют 250 микролитров 0,2 М PMSF (фенилметилсульфонилфторида) и обрабатывают ультразвуком при 4°С, 400 Вт в течение 2 минут. Обломки бактерий удаляют высокоскоростным ультрацентрифугированием при 4°С, 75000×g в течение 1,5 часов. Прибавляют к супернатанту стрептомицин сульфат для осаждения ДНК, диализируют в течение ночи в мешке для диаализа с молекулярным весом 15000, а также с 10 л буфера 50 мМ боратаа, 2 мМ ЭДТА, рН 9,0 при 4°С, и затем загружают на колонку СМ (Amersham Biosciences). Колонку элюируют буфером 50 мМ бората, 0,3 М NaCl, 2 мМ ЭДТА, рН 9,0 для получения анти-цианобактериального рекомбинантного полипептида (1) (см. Фиг. 2).

Использовали следующие последовательности двухцепочечных олигонуклеотидов, сконструированные для получения генов миметиков антитела в плазмиде pCHCcyanoMA1:

pCHCcyanoMA1

Пример 2. Конструирование контрольной плазмиды, экспрессирующей анти-цианобактериальный полипептид и получение контрольного анти-цианобактериального полипептида

Исходным вектором являлась плазмида pSELECT-1 (приобретенная у фирмы Promega Corp.), которая несет гены колицина Ia и иммунный белок (указанные гены загружают в лаборатории, в которой проводились эксперименты данного изобретения). Ген, кодирующий миметики анти-цианобактериального антитела (нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO. 4 в перечне последовательностей), вставляют после сайта I626 гена колицина Ia с помощью технологии сайт-направленного мутагенеза двухцепочечного олигонуклеотида (набор QuickChange™, Strategene Corp.) для получения рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA2 (как представлено на Фиг. 3). Рекомбинантную плазмиду трансфицируют в генно-модифицированные бактерии Е. coli В834 (DE3) для получения полипептида. Был получен указанный анти-цианобактериальный полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO. 9 (тут и далее называемый "анти-цианобактериальный полипептид (2)") и молекулярный вес равен примерно 70000.

Последовательности двухцепочечных олигонуклеотидов для получения генов миметиков антитела в плазмиде pCHCcyanoMA2 были сконструированы и приготовлены в соответствии со способом, описанным в Примере 1.

Пример 3. Результаты экспериментов по ингибированию Microcystis aeruginosa анти-цианобактериальным полипептидом

Эксперимент (1)

Стадия 1. Получение водорослей для эксперимента: Microcystis aeruginosa FACHB-978 были приобретены в Институте гидробиологии Акадамии наук Китая.

Способ культивации водорослей: семена водорослей инокулируют с начальной плотностью клеток 5×10⁴/мл в коническую колбу на 500 мл, содержащую 250 мл среды BG11 и помещают в освещаемый инкубатор, в котором коническую колбу закрывают газопроницаемой пленкой для предотвращения загрязнения. Водоросли культивируют при 25°С при интенсивности освещения (2500±10%) люкс и соотношении свет/тьма 12 ч/12 ч. Конические колбы встряхивают и меняют их положение через каждые 2-3 часа. Отбирают образцы и проводят тестирование через каждые 24 часа, начиная с 5-го дня после инокуляции. Следующая стадия должна быть проведена до того, как плотность клеток достигнет примерно 10⁶/мл.

Стадия 2. Прибавляют 1 мл жидкости с приготовленными цианобактериями, соответственно, в 5 пробирок, а именно А, В, С, D и Е, и затем прибавляют следующие ингибиторы: А - холостой контрольный опыт; В - 50 мкг/мл ампициллина; С - 50 мкг/мл феромона широкого спектра действия (Ph-AM1, раскрытый в патентной заявке № CN 200910092128.4); D - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); Е - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (2). После культивации со встряхиванием с низкой скоростью в течение 12 часов в инкубаторе в 5 пробирок соответственно прибавляют акридиновый оранжевый (50 нМ) и пропидий йодид (600 нМ) для инкубации в течение 30 мин; отбирают несколько микролитров образца на слайд для наблюдения живых окрашенных цианобактерий с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon 90i с фильтром DM505 и DM565).

Результаты представлены на Фиг. 4. Результаты свидетельствуют, что только анти-цианобактериальный полипептид (1) уничтожает культивируемых Microcystis aeruginosa, в то время как ни один из анти-цианобактериального полипептида (2), ампициллина и Ph-NM не оказывает влияния на культивируемых Microcystis aeruginosa.

Эксперимент (2)

Стадия 1. Аналогична Стадии 1 Эксперимента (1).

Стадия 2. Прибавляют анти-цианобактериальные полипептиды с градиентом концентрации в 6 конических колб по 500 мл, заполненных водорослями. Прибавляют анти-цианобактериальный полипептид к Microcystis aeruginosa в дозах 0, 0,1, 0,5, 1, 5 и 10 мкг/мл. Результаты ингибирования цианобактерий наблюдают каждый день.

Результаты представлены на Фиг. 5. Поскольку концентрации анти-цианобактериального полипептида (1) в каждой группе были разными, время изменения окраски жидкости с Microcystis aeruginosa с зеленой до светло-желтой в каждой конической колбе было пропорциональным концентрации анти-цианобактериального полипептида (1). Однако визуально было определено, что Microcystis aeruginosa при всех режимах обработки может быть эффективно уничтожена за 72 часа.

Вышеописанные результаты показывают, что анти-цианобактериальный полипептид (1) способен целенаправленно уничтожать культивируемые Microcystis aeruginosa, в то время как анти-цианобактериальный полипептид (2) не демонстрирует практически никакого эффекта.

Эксперимент (3)

Материал: Scenedesmus obliqnus FACHB-417 были приобретены в Институте гидробиологии Академии наук Китая и культивировались в соответствии со способом Стадии 1 Эксперимента (1).

Стадия 2. Анти-цианобактериальный полипептид (1) прибавляют в 6 конических колб на 500 мл с водорослями с градиентом концентрации 0, 1, 5, 10, 15 и 20 мкг/мл соответственно. Наблюдения ингибирования Scenedesmus проводят каждый день.

Результаты представлены на Фиг. 6. Хотя доза анти-цианобактериального полипептида (1) была в 10 раз выше, чем при добавлении к Microcystis aeruginosa, не наблюдалось визуального эффекта уничтожения Scenedesmus анти-цианобактериальным полипептидом (1) на протяжении эксперимента (190 часов).

Эксперимент (4)

Отбирают 0,1 мл культуральной жидкости из каждой колбы экспериментов (1)-(3) и помещают в камеру для подсчета кровяных клеток для наблюдения и подсчета под микроскопом. Результаты подсчета числа клеток водорослей, приведенные на Фиг. 7, показывают, что, по сравнению с контролем, 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1) может уничтожить Microcystis aeruginosa за 72 часа, в то время как 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1) не демонстрирует практически никакого эффекта против Scenedesmus.

Пример 4. Эксперимент по применению анти-цианобактериального полипептида против Microcystis aeruginosa, Anabaena, Chlorella и Scenedesmus в жидкой культуральной среде.

Microcystis aeruginosa, Anabaena, Chlorella и Scenedesmus были приобретены в Институте гидробиологии Академии наук Китая и культивировались в соответствии со способами, описанными в Стадии 1 Эксперимента (1) Примера 3.

40 мл жидкости с водорослями с плотностью клеток 10⁶/мл распределяют в две конические колбы на 300 мл и прибавляют соответственно А: жидкость для холостого контрольного опыта в таком же количестве, В: 35 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1) и культивируют в течение 4 дней. Проводят наблюдения за ростом.

Результаты представлены на Фиг. 8. Через 24 часа окраска жидкости с водорослями Microcystis aeruginosa и Anabaena светлела, и она становилась прозрачной на четвертый день, в то время как окраска и мутность жидкости с Chlorella и Scenedesmus оставалась неизменной. Результаты показывают, что анти-цианобактериальный полипептид 1 ингибирует рост Microcystis aeruginosa и Anabaena, но не ингибирует рост Chlorella и Scenedesmus.

Вышеописанные результаты подтверждают, что анти-цианобактериальный полипептид (1) способен целенаправленно уничтожать цианобактерии.

Пример 5 Эксперимент по уничтожению цианобактерий в природной воде с помощью анти-цианобактериального полипептида

Природная вода, серьезно загрязненная цианобактериями, была взята из пруда для разведения креветок в озере Suzhou Yangcheng. Разливали по 25-35 л воды в пластиковые резервуары для разведения размером 60×40×30 см, с подачей воздуха путем продувания по 10 минут через каждые 20 мин и автоматическим поддержанием температуры 27°С, интенсивность освещения (2500±10%) люкс и соотношение свет/тьма 12 ч/12 ч. Образцы воды отбироали каждый день для определения рН, поглощения при 650 нм, и поглощения хлорофилла А (см. Фиг. 9).

Поглощение при 650 нм определяли путем помещения образца жидкости в спектрофотометр для видимой области (см. Фиг. 10).

Содержание хлорофилла А определяли спектрофотометрически с помощью метода замораживания-оттаивания горячим этанолом (hot ethanol-freeze thawing) (см. Фиг. 10). Поглощение при 650 и 700 нм определяли с помощью спектрофотометра, с расчетом концентрации хлорофилла A ([Chla]) по формуле:

[Chla]=[12,12(D664-D750)-1,58(D647-D750)-0,08(D630-D750)]VE/VS·d

Значения рН, поглощения при 650 нм и поглощения хлорофилла А в воде для контрольной группы оставались высокими на протяжении эксперимента, тогда как показатели для группы анти-цианобактериального полипептида (1) и группы сульфата меди резко снижались со второго дня.

Отбирали каждый день 30 мл образца воды, фиксировали формалином и затем концентрировали 10-кратно центрифугированием. Отбирали 0,1 мл в камеру для подсчета кровяных клеток для проведения наблюдений и подсчета под микроскопом (см. Фиг. 11). Микроскопические исследования показали, что в первый день наблюдалось большое количество цветущих Anabaena в контрольной группе, группе анти-цианобактериального полипептида (1) и группе сульфата меди; тогда как со второго дня количество Anabaena в группе анти-цианобактериального полипептида (1) и в группе сульфата меди уменьшалось и они в значительной степени фрагментировались в воде; и Anabaena не наблюдались в группе анти-цианобактериального полипептида (1) и группе сульфата меди на пятый день, но большое количество Anabaena в контрольной группе оставались живыми.

Изменения формы водорослей наблюдали под микроскопом, и подсчитывали количество различных водорослей для определения динамических изменений доминирующей популяции плавающих растений в воде (см. Фиг. 10). В контрольной группе, Anabaena и Microcystis aeruginosa были доминирующими водорослями все время; в группе анти-цианобактериального полипептида (1) количество Anabaena и Microcystis aeruginosa постепенно уменьшалось и доминирующими становились Chlorella; в группе сульфата меди количество Anabaena и Microcystis aeruginosa постепенно уменьшалось и доминирующим становились другие цианобактерии - Oscillatoria.

Результаты представлены на Фиг. 9-11 и в таблице 1. Результаты показывают, что 0,7 ppm (млн^-1) сульфата меди неизбирательно уничтожает все виды водорослей. Однако анти-цианобактериальный полипептид (1) целенаправленно ингибирует рост цианобактерий (Anabaena, Microcystis aeruginosa) в воде, но лишь незначительно влияет на рост другого фитопланктона.