МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ С ПРОТИВОРАКОВЫМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения

Область техники

Изобретение относится к медицине, а именно, к фармации и онкологии и предна- значено для лечения онкологических заболеваний человека.

Предшествующий уровень техники

Среди существующих новых направлений в лечении онкологических заболеваний существует ряд весьма перспективных подходов. Одним из таких подходов можно счи- тать разработку препаратов для генной терапии рака [']. В данном подходе основным дей- ствующим началом являются полинуклеотиды. Генную терапию можно разделить на две большие группы: средства для инактивации генов [ ] и средства для внесения генного ма- териала внутрь клетки [³]. Инактиваторы генов еще называют antisense полинуклеотиды [⁴]. Многочисленные исследования, которые проводятся в данном направлении, реально эффективных in vivo препаратов не выявили. Это связано с целым рядом проблем: синте- зированные ДНК (РНК) быстро разрушались нуклеазами крови [⁵], не проникали внутрь клеток, разрушались системами репарации генома [⁶]. Иногда in vitro наблюдалась кратко- временная блокада экспрессии белков-мишеней, накопление в гепатоцитах [⁷]. Существу- ют разные подходы к проектированию antisense олитонуклеотидов, но принцип их взаи- мо действия с мишенями остается один: образование водородных связей между компле- ментарными нуклеотидами при увеличении степени устойчивости к нуклеазам [ ]. В од- них случаях разработчики защищали от действия нуклеаз 5'- конец олигонуклеотида, в других- модифицировали 3'- конец [⁹,¹⁰]. Исследователи из США заменили дезоксирибо- зильные остатки на фрагменты морфолина с целью создать устойчивые к действию нукле- аз фрагменты ДНК (РНК) [^п,¹²]. При этом принцип инактивации генов путем их компле- ментарного взаимодействия с antisense-нуклеотидами остался прежним - образование во- дородных связей. Именно эта водородная связь и является основной причиной неэффек- тивности существующих препаратов на основе antisense - ДНК (РНК). Ферменты типа ге- ликаз [¹³] очень быстро и легко раскручивают гибридизованную с геном-мишенью antisense - ДНК и активность гена снова восстанавливается.

Известны нуклеотидные последовательности, связанные с развитием рака пред- стательной железы и легких [¹⁴]. Механизм действия этих микроРНК связан с подавлени- ем синтеза белка, через блокаду трансляции матричной РНК. Авторы запатентовали по- следовательности микроРНК, подтвердили их эффекты в клеточных культурах, показали специфичность данных олигонуклеотидов к этим двум видам опухолей. Основными не- достатками патента является то, что авторы не показали возможные пути применения данных микроРНК для борьбы с онкологическими заболеваниями, не показали, как можно защитить эти олигонуклеотиды от действия нуклеаз в организме, не показали противора- кового эффекта препаратов на основе этих микроРНК.

Наиболее близким прототипом являются олигонуклеотиды содержащие модифи- цированные и неприродные нуклеотидные основания [¹⁵]. Механизм действия запатенто- ванных олигонуклеотидов был аналогичен antisense RNA и micro RNA, а препараты могли применяться в лечении, в том числе онкологических заболеваний. Недостатком патентуе- мых олигонуклеотидов является применение природного принципа образования связи с РНК-мишенью - водородной связи, чувствительной к нуклеазам и геликазам. Кроме того, патентовалась четкая статическая химическая структура, не способная адаптироваться к окружающим условиям. Применение объекта данного патента не было эффективным в экспериментах на моделях животных при онкологических заболеваниях, кроме того, дан- ная разработка применима более для диагностических и скрининговых исследований in vitro, чем создание препаратов для лечения животных и человека в связи с тем, что пред- лагаемые модификации нуклеотидных оснований являются новыми ксенобиотиками и не подлежат безопасному метаболизму и биодеградации в организме.

Раскрытие изобретения

В основу изобретения поставленная задача разработать модифицированные анти- комплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получе- ния.

Поставленная задача решается путем получения модифицированных антиком- плементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами отличающимися тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь (ансамбль) продуктов гидролиза по- линуклеотидов, а модификацию проводят путем изменения на противоположный знак зарядов молекул нуклеотидных оснований, приобретающих при этом антикомплиментар- ные свойства.

Также поставленная задача решается путем разработки способа получения моди- фицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, отличающегося тем, что для их получения сперва проводят частичный гидролиз поли- нуклеотидов ( ДНК, РНК или их смеси) растительного, животного, микробного или гриб- кового происхождения химическим или биохимическим (ферментативным) путем, а затем проводят процесс химической модификации суммы полученных олигонуклеотидов с за- меной заряда молекул их нуклеотидных оснований на противоположный путем алкилиро- ванием монохлоруксусной кислотой или ацилированием янтарным ангидридом и исполь- зуют в качестве противоракового средства смесь (ансамбль) из полученных антикомпле- ментарных олигонуклеотидов.

Краткое описание чертежей Фиг. 1.- Специфичная гибридизация ацилированных РНК только со своими предшествен- никами (ниже - та же реакция с ДНК-плазмидами)

Фиг. 2. - Замена водородной связи на ионную при образовании гибридов между антикан и мишенями

Фиг. 3- Саркома. Окраска гематоксилин - эозин.

Лучший вариант осуществления изобретения

В наших ранних исследованиях при изучении ацилированных полинуклеотидов был выявлен новый феномен: ацилированные по экзоциклическим аминогруппам поли- нуклеотиды селективно гибридизуются только со своими неацилированными предшест- венниками. Плазмида pUC18 гибридизовалась только со своим ацилированным производ- ным, а плазмида pBR322 гибридизовалась соответственно только с ацилированной pBR322 (Фиг.1). При этом образовывались нерастворимые, неплавкие конъюгаты. Именно свойство неплавкости отличало классические двухспиральные ДНК от полученных гиб- ридов. Они не плавились ни при какой температуре и не растворялись ни в чем, кроме концентрированных щелочей. Данное свойство синтезированных ацил-ДНК мы объясня- ем изменением самого принципа образования связи между цепями ДНК: с водородной на ионную и смешанную.

Такая связь (Фиг. 2) абсолютно не предусмотрена природными механизмами репа- рации. Таким образом, клеточные геликазы и нуклеазы будут неэффективными при обра- зовании гибридов между такими ацил-ДНК (РНК) и их неацилированными предшествен- никами. Кроме полинуклеотидов, нами была показаны зависимость заряд-активность и в ряду других ацилированных биополимеров: белков, полисахаридов, полинуклеотидов, з таннидов, бактериофагов, иммуноглобулинов. На основе этих исследований разработан и внедрен новый ветеринарный противовирусный препарат [¹⁶]. Нами было установлено, что определенная прецизионная модификация структуры биополимера способна или уве- личить его биологическую активность, полностью изменить свойства или привести к об- разованию самоорганизующихся структур. Обнаруженные нами закономерности были положены в основу принципа получения микроРНК с ацилированными экзоциклическими аминогруппами. Нами использован ансамбль из олигонуклеотидов - продуктов гидролиза полинуклеотидов, но с измененными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии— супрамоле- кулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сбор- ке сложнейших пространственных структур в живой клетке [¹⁷,¹⁸]

Данный препарат получил название антикан. Ранее нами были изучены липосо- мальные формы некоторых перспективных препаратов и на основе тех данных разработа- на лекарственная форма для антикан

МикроРНК это новый класс некодирующих РНК длинной 18-25 нуклеотидов, ко- торые негативно регулируют посттрансляционную экспрессию генов. Механизм действия этих малых фрагментов РНК основан на взаимодействии (гибридизации) микроРНК с матричной РНК прямо в полирибосомальном комплексе. Такая гибридизация приводит к остановке синтеза конкретного белка. Роль микроРНК в онкогенезе и перспективы ис- пользования микроРНК в терапии рака представлены в обзоре [¹⁹]. Но микроРНК не спо- собны самопроизвольно проникать через клеточную мембрану. В настоящий момент ве- дутся исследования по созданию разнообразных транспортных систем для доставки мик- роРНК в клетки-мишени. Наиболее перспективными носителями являются липосомы, по- лимерные наночастицы, самоорганизующиеся полимеры.

Известна способность многих аденокарцином захватывать из межклеточного мат- рикса посредством пиноцитоза олигонуклеотиды и наночастицы [²⁰,²¹]. При этом здоро- вые клетки не способны захватывать малые олигонуклеотиды и липосомы [ ]. Это обес- печивает селективность накопления антикан в раковых клеток и отсутствие токсичности у препарата. Для получения антикан нами была использована суммарная дрожжевая РНК, фрагментированная панкреатической нуклеазой до фрагментов размерами от 2 н до 15 н с Затем экзоциклические аминогруппы этих олигонуклеотидов были модифицированы с заменой заряда. Для усиления накопления антикан в опухоли, он был включен в монола- мелярные фосфотидилхолиновые липосомы. Селективное накопление в раковой клетке антикан приводит к его гибридизации с комплементарными мишенями в матричной РНК раковой клетки и к постепенной остановке синтеза белка, антикан блокирует не только интронные, но экзонные области в матричной РНК, что приводит практически к мгновен- ной остановке синтеза белка Действие антикан основано на индукции апоптоза через ос- тановку синтеза белка, антикан фактически не влияет на здоровые клетки, блокирует син- тез всех клеточных белков, исключает адаптацию раковой опухоли к терапии и селекцию устойчивых клеток.

Молекулярный механизм действия препарата не изучался.

Антикан кроме противораковой активности in vitro, также проявил высокую актив- ность in vivo на моделях бензидиновой саркомы у крыс, асцитной аденокарциномы Эрли- ха у мышей (данные представлены в отчете).

Пример 1.- Получение ансамбля (смеси) модифицированных олигонуклеотидов (Ан- тикан)

Микробная биомасса содержит до 11% нуклеиновых кислот и может служить сырьем для получения микробной РНК, на основе которой возможно получение дерина- тов, представляющих собой смесь олигонуклеотидов. Объектом исследований данного этапа работы явилась РНК, выделенная из биомассы дрожжей p. Saccharomyces cerevisiae Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. Размораживали при ком- натной температуре 4 кг прессованных дрожжей, измельчали их и суспендировали в 8 л кипящей воды, содержащей 300 г ДДС-Na. Суспензию кипятили 40 мин при непрерыв- ном перемешивании, затем разливали по стальным центрифужным стаканам, помещали их немедленно в лед и охлаждали до 5 °С (~15 мин), после чего центрифугировали на центрифуге 6К15 производства Германии (17000 g, 10 мин, 4°С). Осадок и часть желеоб- разной интерфазы отбрасывали, а перешедшую в надосадочную жидкость РНК очищали. Для этого к надосадочной жидкости, полученной на предыдущей стадии, добавляли NaCl до конечной концентрации 3 М. После растворения соли суспензию выдерживали в тече- ние 1 ч для формирования осадка, который далее отделяли центрифугированием при 17000 g, в течение 10 мин. Осадок промывали двумя порциями по 8 л 3 М NaCl, суспенди- ровали в 2 л этанола и оставляли на ночь. На следующий день суспензию центрифугиро- вали при 17000 g, в течение 10 мин. Осадок растворяли в дистиллированной воде до кон- центрации РНК 450 D260 ,ед./мл (-1,6 л). Раствор осветляли центрифугированием при тех же условиях, после чего из надосадочной жидкости РНК осаждали, добавляя NaCl до ко- нечной концентрации 0,15 М и равный объем этанола (-2 л). Сформировавшийся осадок отделяли от супернатанта центрифугированием (17000 g, 10 мин), промывали 1 л этанола и высушивали в вакуум— эксикаторе над СаС1 . Все операции проводили при 0-4 °С. Выделение высокополимерной РНК из пекарских дрожжей

День 1— экстракция РНК. Растворяли 7,5 г ДЦС-Na в 300 мл воды в термостой- ком стеклянном стакане на 1 л, доводили раствор до кипения и высыпали в него в течение 5 мин 30 г сухих дрожжей так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 98 °С. Полученную суспензию кипятили 40 мин при непрерывном перемешивании и по мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 300 мл. По окончании экстракции суспен- зию охлаждали до ~ 60 °С, добавляли в нее свежевскипяченную воду до 450 мл, переме- шивали, переносили в мерный цилиндр на 500 мл и ставили отстаиваться при 20 °С на 22 ч. День 2— высаливание РНК и промывка высоленной РНК 3 М NaCl. Отстоявшийся супернатант (280 мл) переносили в мерный стеклянный стакан объемом 500 мл, добавляли в него 81 г NaCl и воду до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19 °С на 6 ч. Через 6 ч образовавшуюся интерфазу (250 мл) отбирали, а в разделившуюся на 2 фракции (часть осела, часть всплыла) высоленную РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемеши- вали и ставили отстаиваться при 19 °С на ночь.

День 3— промывка высоленной РНК 3 М NaCl.

Интерфазу (300 мл) отбирали, а к высоленной РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19 °С на 5 ч. Через 5 ч интерфазу (280 мл) от- бирали, а к высоленной РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили от- стаиваться при 19 °С на 3 ч. Через 3 ч интерфазу (250 мл) отбирали, а к высоленной

РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19

°С на ночь.

День 4— промывка высоленной РНК спиртом. Верхнего слоя почти нет. Оса- док занимает объем - 100 мл. Супернатант удаляли, а к осадку добавляли этанол до 300 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 18 °С на 5 ч. Через 5 ч супернатант слива- ли, а к осадку (140 мл) добавляли свежую порцию этанола до 320 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19 °С на 40 мин, после чего супернатант сливали, а к осадку (120 мл) добавляли 120 мл свежего этанола, перемешивали и через 30 мин отстоя суперна- тант сливали. К осадку (110 мл) добавляли 110 мл свежего этанола, перемешивали и через 30 мин отстоя супернатант сливали, а суспензию РНК выливали тонким слоем в плоскую ванночку и сушили на воздухе при комнатной температуре до отсутствия запаха спирта. Чистую высокополимерную РНК из высушенного полуфабриката выделяли экстракцией водой в целлофановом диализном мешке.

Ферментативный гидролиз полученной суммы РНК. В качестве нуклеазы бы- ла выбрана панкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза) с активностью 14000 ед./мг в коли- честве 0,4 % от массы РЫК. Гидролиз РНК проводили в течение 4 часов. Гидролизат вы- сушивали в распылительной сушилке.

Химическая модификация олигонуклеотидов гидролизата. Получали 3,5 % водный раствор гидролизата, добавляляли янтарный ангидрид в количестве от 10 до 45% от сухой массы гидролизата, перемешивали на холоде до полного растворения ангидрида. Полученный раствор стерилизовали 120 минут текучим паром. Готовый раствор далее ис- следовали на предмет наличия противораковых свойств.

Пример 2.— Изучение острой токсичности Антикана

Было поставлено 36 серий опытов на 220 животных.

Среднесмертельную дозу антикана устанавливали на 3 видах животных : безпоро- дних белых мышах массой 20-22 г, белых крысах массой 190-200 г и морских свинках массой 300-400 г обоего пола при внутривенном введении. С целью сравнения широты терапевтического действия антикана и препарата сравнения - таксотера - мы устанавлива- ли сруднесмертульную дозу таксотера также при внутривенном введении.

Расчет среднесмертельной дозы проводили по методу Б.М. Штабского с использо- ванием уравнения :

Y - a

Х = (1)

а

Where Y- % of effect

Υι - Υι

a =

X_x - X₂ где :

XI и Х2 - значение двух крайних из трех исследованных доз, которые имеют эффект в ме- нее или более 50% животных, третья доза является промежуточной;

Y1 и Υ2- проценты летальности, которые отвечают дозам XI и Х2;

ΣΥ- сумма трех исследованных доз;

количество доз, которые использовались при расчетах равно 3.

При подстановке к формуле (1) значения Υ, которое составляет 50,84,16 процентов смертности, рассчитывали LDso, LD 84 и LD ι₆- Потом находили d- среднюю ошибку среднесмертельной дозы, благодаря использованию формулы Миллера-Тейнтера:

2 5

т=

2N

LD 84- LD 16,

Ν-общее количество животных в группах, в которых погибло или выжило хоть од- но животное, и устанавливали доверительные интервалы.

Мышам антикан вводили внутривенно медленно (перед использованием готовили векторные липосомы : к сухому лиофилизированному порошку АНТИКАН, который бра- ли в соответствующих дозах, добавляли раствор 0,9 % натрию хлорида) в дозах 1000,1500,2000,2500,3500 мкг/кг массы животного. Анализ результатов свидетельствует об о том, что среднесмертельная доза препарата для этого вида животных составляет 2780 мкг/кг .

Исследование антикана на крысах в дозах 1000, 2000,2500,3000, 3500, 4000 мкг/кг дало возможность рассчитать среднесмертельную дозу для этого вида животных - 2590 мкг/кг. Среднесмертельная доза антикана для для морских свинок составляет 2420 мкг/кг массы.

При внутривенном пути использования таксотера крысам LD 50 = 120 мкг/кг массы тела.

Сравнительная характеристика Антикана и Таксотера приведена в табл. 5. Таблица 1 - Сравнительные характеристики Антикана и Таксотера.

Анализ полученных данных, которые показаны в таблице 1, приводит к выводу о том, что антикан в липосомах менее токсичен, чем препарат таскотер, и превосходит пре- парат сравнения по эффективной дозе. Терапевтический индекс, который характеризует широту терапевтического действия, у антикана в 151,5 раз больше, чем у препарата срав- нения благодаря липосомальной форме. Для экстраполяции токсичности антикана на че- ловека мы рассчитали коэффициент видовой чувствительности (КВЧ) по формуле :

LD50 (для крыс) 2590

КВЧ— = 0,9

LD50 (для мышей) 2780

Таким образом, антикан не имеет видовой чувствительности или она медленно вы- ражена.

Пример 3- Противораковая активность антикана

Определение противораковой активности антикана в клеточной культуре прово- дили в культуре клеток HeLa-2. Для этого к среде 199 добавляли разное количество анти- кана от 2 до 12 мкг/мл среды, (см.таб 2) Для контроля использовали культуру без антика- на. Наблюдение за культурами клеток вели в течение 5 суток с ежедневным просмотром. Минимальной активной дозой (МАД) антикана считали такое его минимальное количест- во, которое вызывало дегенерацию 90-95% клеток (Таб. 2) Таблица 2 - Сравнительная характеристика чувствительности культуры опухоле- вых клеток HeLa-2 относительно антикана.

Цитопатическое действие;

M i l дегенерация 100% клеток

0 отсутствие дегенерации.

При установлении минимальной концентрации антикана, которая тормозит рост клеток проведено сопоставление количества клеток, которые выжили, и концентрацией антикана в растворе.

Таблиця 3 - Влияние антикана на клетки HeLa

Доза , мкг/мл Количество клеток Количество жи- Количество живых до инкубации, млн вых клеток после клеток после инку- инкубации, млн, бации, %

±1000

анти- таксотер анти- таксотер кан ткан

Как видно из таблицы 3, эффективная доза антикана находится в пределах между 8-12 мкг/мл раствора.

Антикан приводил к 95 % дегенерации опухолевых клеток. Для подтверждения противоопухолевого действия in vivo антикан был исследован на моделях бензидиновой кожной саркомы и перевивной асцитной аденокарциномы у барбадосских мышей. На 5 мышах с аденокарциномой также исследовали распределение липосом антикана по орга- низму животных благодаря флуоресцентному зонду, растворенному в фосфолипидной оболочке. Пример 4.— Изучение противораковой активности антикана на модели бензидино- вой саркомы (Фиг. 3.)

Перед применением к силикагелю добавляли 7 мл раствору 2% бензидина в 0,9 % натрия хлориде до образования опалесцирующей суспензии ( 1 г силикагеля на 5 мл физ. раствора). Двадцати пяти мышам барбадосской линии массой 18-20 г обоего пола, кото- рых удерживали на рационе вивария через каждых 3 суток подкожно вводили возле шеи иммобилизированные на силикагеле бензидин и форболацетат . Через две недели у 18 жи- вотньгх появились опухоли разных размеров в виде небольшого бугра на шее около сили- кагелевой грануломы. Каждой группе животных вводили парентерально соответствующее соединение в дозе 100 мкг/кг массы два раза на сутки два недели, начиная с 16 дня после введения канцерогена.

Таблица 4 - Сравнение противоопухолевого действия антикана против соединения - аналога (таксотера) и липина.

Название препарата Масса животных (г)

До лечения После лечения

Таксотер 28 ±1,2 23± 1,1 (2 мыши погибли)

Антикан 25± 1,7 15± 1,5

Липосомы пустые 26± 2,1 34 ±1,3 (5 мышей погибло) Примечание: n=7, p>0,05 по сравнению с контролем и предыдущими данными.

Как видно из таблицы 4, антикан уменьшал массу подопытных животных на 10 г, при этом у контрольных животных масса тела продолжала расти, и некоторые из них умерли. После анатомического исследования силикагелевой грануломы было установле- но, что животные, которых лечили антиканом не имели признаков злокачественного пре- вращения грануломы в саркому.

Сроки гибели животных приведены в таб 5.

Таблица 5 - Сроки гибели животных с бензидиновой саркомой кожи

Примечание: п=10, р>0,05 по сравнению с контролем и предыдущими данными. Таким образом, антикан увеличивает вдвое против таксотера продолжительность жизни животных.

Пример 5.- Исследование противоопухолевого действия Антикана на асцитной аде- нокарциноме Эрлиха

Противоопухолевое действие композиций исследовали на моделях асцитной кар- циномы Эрлиха у молодых мьппей барбадосской линии обоего пола массой 15-17 г (68 штук), которых выдерживали на рационе вивария.

45 мышам инокулировали от мыши с аденокарциномой инсулиновым шприцем 0,1 мл асцитной жидкости в область печенки. Через 7 суток у 42 мьппей появились при- знаки опухоли (увеличилась масса тела и размеры живота), 2 мыши погибли на второй день, 1 мышь не подала признаки опухоли.

Десяти мышам вводили антикан в липосомальном виде(см. Таб 6) Еще 10 мышам вводили субстанцию антикана, еще десяти - 0,9% раствор натрия хлорида с липином. Таблица 6 - Количественные биологические и статистические характеристики при исследовании противоопухолевой активности антикана.

Примечание: п=10, р>0,05 в сравнении с контролем и предыдущими данными. Антикан вводили тем мышам, в которых брали кровь. Мыши с аденокарциномой

Эрлиха после перевивки опухоли и лечения жили 18 суток при использовании субстан- ции антикана, что в 6 раз дольше, чем в контроле, и 37 суток при использовании антикана в липосомах, что в 12 раз дольше, чем в контроле. При достоверности больше 99,5% мож- но утверждать о значительном усилении противораковой активности липосомального ан- тикана против контроля - таксотера. После анатомирования животных признаков опухо- лей и метастазов в органах животных найдено не было.

Пример 6.- Исследование распределения липосом Антикана по организму живот- пых.

Для исследования распределения липосом по органам животных использовали биологически инертный 5,6- бензокумарин, который имеет липофыильный характер и флюоресцентные свойства. Последний растворяли в спирте (0,5 М раствор), и добавляли к раствору Фосфолипиду при создании липосом в количестве 0,01 мл раствора кумарину на 10 мл раствора фосфолипида. Наибольшая флуоресценция наблюдалась в печени и в ас- цитной жидкости, которая подтверждает тропность липосом к опухоли. В контроле липо- сомы распределялись в селезенку, печень и лимфоузлы.

Распределение липосом изучали в организме мышей- опухоленосителей (5 живот- ных) и здоровых крыс (5 животных) после инфузионного введения антикана. Антикан вводили в дозе 100 мкг/кг. Через 5 часов животных забивали, и исследовали интенсив- ность флюоресценции на флюориметре HP-F-40M.

Таблица 7 - Накопление антикана в зависимости от скорости введения.

Животные Орган Форма введения анти- Флуоресценция, % *

кана

-II- плазма 23,2+0,1

-II- печень 60,2±0,1

-II- легкие 0,2±0,1

-II- селезенка 0,5+0,1

-II- почки 0,3±0,1

-II- асцитная 5,2±0,1

жидкость

* относительная флуоресценция - процент флуоресценции относительно интенсив- ности флуоресценции введенного раствора антикана.

Как видно из таблицы, при наличии опухоли, накопление антикана идет там, но в зависимости от срока инфузии. Чем быстрее вводится антикан, тем больше его накаплива- ется в печени. Поэтому рациональным является введение антикана в виде медленных ин- фузий.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а конкретно к онкологии, и мо- жет быть использовано в лечение онкологических инфекций животных и человека.

Промышленная применимость

Изобретение относится к медицине и фармации, а именно к онкологии и фармации и может быть использовано для создания новых более эффективных противораковых препаратов, представляющих собой динамические самоадаптирующиеся и самоорганизующиеся системы. Полученные таким образом препараты являются полностью экологически безопасными, биодеградируемыми и полностью метаболизируемыми как в организме пациентов, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство подобных препаратов осуществимо на существующем оборудовании фармацевтических предприятий и не требует уникального оборудования. Сырьевая база доступна и не требует дополнительных усилий для выращивания или производства. Использованные источники информации

^I Galasso М, Elena Sana М, Volinia S. Non-coding RNAs: a key to future personalized molecu- lar therapy?// Genome Med. 2010 Feb 18;2(2):12.

Jung J, Solanki A, Memoli KA, Kamei K, Kim H, Drahl MA, Williams LJ, Tseng HR, Lee K. Selective inhibition of human brain tumor cells through multifunctional quantum-dot-based siRNA delivery// Angew Chem Int Ed Engl. 2010;49(l):103-7.

³ Li X, Liu Y, Wen Z, Li C, Lu H, Tian M, Jin K, Sun L, Gao P, Yang E, Xu X, Kan S, Wang Z, Wang Y, Jin N. Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus expressing apoptin in vitro and in vivo// Mol Cancer. 2010 Jan 20;9:10.

⁴ Emmrich S, Wang W, John K, Li W, Ptitzer BM. Antisense gapmers selectively suppress indi- vidual oncogenic p73 splice isoforms and inhibit tumor growth in vivo// Mol Cancer. 2009 Aug 11;8:61.

⁵ Fisher M, Abramov M, Van Aerschot A, Rozenski J, Dixit V, Juliano RL, Herdewijn P. Bio- logical effects of hexitol and altritol-modified siRNAs targeting B-Raf// Eur J Pharmacol. 2009 Mar 15;606(l-3):38-44

⁶ Czauderna F, Fechtner M, Dames S, Aygiin H, Klippel A, Pronk GJ, Giese K, Kaufmann J. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells// Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1;31(11):2705-16.

⁷ Crooke RM, Graham MJ, Martin MJ, Lemonidis KM, Wyrzykiewiecz T, Cummins LL. Me- tabolism of antisense oligonucleotides in rat liver homogenates. J Pharmacol Exp Ther. 2000 Jan;292(l): 140-9.

⁸ Monia BP, Johnston JF, Sasmor H, Cummins LL.Nuclease resistance and antisense activity of modified oligonucleotides targeted to Ha-ras. J Biol Chem. 1996 Jun 14;271(24):14533-40.

⁹ Giles RV, Spiller DG, Green JA, Clark RE, Tidd DM. Optimization of antisense oligode- oxynucleotide structure for targeting bcr-abl mRNA. Blood. 1995 Jul 15;86(2):744-54.

¹⁰ Xodo L, Alunni-Fabbroni M, Manzini G, Quadrifoglio F. Pyrimidine phosphorothioate oli- gonucleotides form triple-stranded helices and promote transcription inhibition. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 25;22(16):3322-30.

^{I I} Sazani P, Weller DL, Shrewsbury SB. Safety pharmacology and genotoxicity evaluation of AVI-4658.ini J Toxicol. 2010 Mar-Apr;29(2): 143-56.

¹² Mourich DV, Jendrzejewski JL, Marshall NB, Hinrichs DJ, Iversen PL, Brand RM. An- tisense targeting of cFLIP sensitizes activated T cells to undergo apoptosis and desensitizes responses to contact dermatitis. J Invest Dermatol. 2009 Aug;129(8):1945-53. Belon CA, Frick DN. Helicase inhibitors as specifically targeted antiviral therapy for hepati- tis C. Future Virol. 2009 May l ;4(3):277-293

¹⁴ Патент США j 7709616 «микроРНК и ее использование».

¹⁵ Патент США N° 7579451 Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleo- base

¹⁶ http://www.agrovet.com.ua/index.php?id=25

¹⁷ http://dic.acadernic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240

Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)¹⁹ Bagnyukoval T.V., Pogribny LP. Chekhun V.F. MicroRNAs in normal and cancer cells: A

New class of gene expression regulators// Experimental Oncology.-2006, N 28.- P. 263-269 Steinhauser I, Langer K, Strebhardt K, Spankuch B. Uptake of plasmid-loaded nanoparticles in breast cancer cells and effect on Plkl expression. J Drug Target. 2009 Sep;17(8):627-37.

Lu JJ, Langer R, Chen J.A novel mechanism is involved in cationic lipid-mediated functional siRNA delivery. Mol Pharm. 2009 May-Jun;6(3):763-71.

2² Moreira JN, Santos A, Moura V, Pedroso de Lima MC, Simoes S. Non- viral lipid-based nanoparticles for targeted cancer systemic gene silencing. J Nanosci Nanotechnol. 2008

May;8(5):2187-204.