PROLINE DERIVATIVE AND APPLICATION THEREOF IN PREPARING DRUG FOR TREATING CARDIOVASCULAR AND CEREBROVASCULAR DISEASE

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种脯氨酸衍生物及其制备方法和在制备治疗心脑血管类疾病的药物中的应用。

脑卒中是严重危害人类生命安全的难治性疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。在2008年我国卫生部公布的死因顺位中，脑卒中在城市中为第三位的致死原因，在农村中为第二位的致死原因。流行病学调查显示近年来青年脑卒中的发病率越来越高，其中45岁以下成人发生的脑卒中，在西方国家及国内报道的比例分别为5％和13.44％。脑卒中按其性质分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占卒中病人总数的75％～85％。

缺血性脑卒中治疗有多种治疗方式，药物治疗是目前脑卒中治疗采取的主要治疗方式之一。目前临床使用的治疗药物主要分为以下几类：溶栓药物、抗血小板聚集药物、降纤药物、抗凝药物和神经保护药物等。经过不懈地努力，在缺血性脑卒中治疗药物的研究中已取得了很大进展，但还有很多问题仍未解决。如溶栓“时间窗”扩展的应用范围、抗凝降纤治疗的药物选择和联合使用、神经保护药物的临床有效性和安全性等。随着对脑卒中发病原因和疾病机制研究的深入，我们对治疗靶点的认识也逐渐清晰、全面，这为脑卒中治疗药物的研究和临床使用提供了更多的研究方向。

益母草苦辛、微寒，归肝、心包经，有活血、调经、祛瘀生新、利尿消肿等功效。主治月经不调、崩漏难产、痛经、产后瘀阻等症，素有“血家圣药”、“经产良药”之称。水苏碱(Stachydrine)和益母草碱(Leonurine)是中药益母草的主要有效成分之一。动物研究显示水苏碱和益母草碱在动物模型组均显示出抗缺血性脑卒中活性，但是水苏碱半衰期短，体内抗缺血性脑卒中活性差。而益母草碱在体内易发生葡萄糖醛酸化，生物利用度低。

本发明意在结合水苏碱和益母草碱的优势，以开发高效的新型心脑血管药物。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提供了一系列基于脯氨酸结构的衍生物及其在制备治疗心脑血管类疾病的药物中的应用。本发明经药理学实验证明，本发明 所述基于脯氨酸结构的衍生物具有保护神经作用，对于缺血性脑卒中等都具有良好的治疗效果。

本发明的另一目的是提供脯氨酸衍生物的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

提供一种脯氨酸衍生物及其立体异构体或者其药学上可接受的盐，所述脯氨酸衍生物具有如式(I)所示的结构：

其中：

R₁、R₂、R₃和R₄分别独立地选自O(CH₂)_nCH₃、卤素原子、H、CF₃、OCF₃、OH、SH、NH₂、羧基、酯基、砜基、亚砜基、磺酸基、磺酸酯基、磺酰胺基、酮基、醛基、硝基、亚硝基、C_1-12的烃基和C_1-12的芳基；n为0或者正整数；

R₅为H、CF₃、OCF₃、OH、C_1-12的烃基或C_1-12的芳基；

R₆、R₇和R₈分别独立地选自卤素原子、H、CF₃、OCF₃、OH、SH、NH₂、羧基、酯基、砜基、亚砜基、磺酸基、磺酸酯基、磺酰胺基、酮基、醛基、硝基、亚硝基、C_1-12的烃基和C_1-12的芳基；

X为O或NH；

Y为

R₉选自任意一种天然氨基酸的侧链，所述天然氨基酸不包括脯氨酸；

R₁₀为H、羧基、酰胺基或酯基。

较佳地，所述天然氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、或组氨酸。

在一个优选的实施例中，本发明脯氨酸衍生物可以具有如式(II)所示的结构：

其中，R₁、R₂、R₃和R₄分别独立地选自O(CH₂)_nCH₃、卤素原子、H、CF₃、OCF₃、OH、SH、NH₂、羧基、酯基、砜基、亚砜基、磺酸基、磺酸酯基、磺酰胺基、酮基、醛基、硝基、亚硝基、C_1-12的烃基和C_1-12的芳基，n为0或者正整数。较佳地，所述R₁、R₂、R₃和R₄分别独立地选自H和OCH₃。更佳地，所述脯氨酸衍生物选自

在另一优选的实施例中，本发明所述脯氨酸衍生物具有如式(III)所示的结构：

其中，X为O或NH；

Y为

R₉选自任意一种天然氨基酸的侧链，所述天然氨基酸不包括脯氨酸；

R₁₀为H、羧基、酰胺基或酯基。

较佳地，所述天然氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯 丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、或组氨酸。

本发明另一方面提供上述任一脯氨酸衍生物及其立体异构体或者其药学上可接受的盐在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用；优选地，所述心脑血管疾病选自于缺血性脑卒中、脑梗塞、脑中风或脑动脉硬化；最优选地，所述心脑血管疾病为缺血性脑卒中。

本发明还提供脯氨酸衍生物的制备方法，它包括如下步骤：

(1)L-脯氨酸a与甲醛在钯碳催化作用下加氢反应制得N-甲基-L-脯氨酸b：

(2)所述N-甲基-L-脯氨酸b分别与化合物m在二环己基碳二亚胺作用下发生缩合反应分别制得脯氨酸衍生物c，其中化合物m优选地为邻氨基苯甲酸、γ-氨基丁酰胺、谷氨酰胺或甘氨酸；

(3)所述脯氨酸衍生物c与益母草碱在二环己基碳二亚胺作用下发生缩合反应制得本发明式(III)脯氨酸衍生物。

与现有技术相比，本发明所设计合成的脯氨酸衍生物在神经保护、抗氧化、抑制细胞毒性、抗凝等方面具有优于水苏碱及阳性药的活性，具有开发为治疗心脑血管类疾病药物的广阔前景。

图1显示实施例5大鼠动脉阻塞模型中不同组别的大鼠脑梗死面积。

除非另有说明，否则本文中所使用的科学与技术术语应具有那些本领域普通技术人员通常理解的含义。

本发明所述的卤素原子包括F、Cl、Br或I，所述的烃基包括饱和或不饱和的开链烃基、饱和或不饱和的环状烃基。

本发明所述的药学上可接受的盐包括无机酸和有机酸衍生的盐。优选地，所述无机酸可以是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸；所述有机酸可以是甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、乙酸、三氟乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸。更优选地，所述的药学上可接受的盐为盐酸盐。

本发明所述的天然氨基酸是指能够构成蛋白质的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。除脯氨酸之外，这些氨基酸具备如下的通式结构：

其中R即为天然氨基酸的侧链。

本发明提供的脯氨酸衍生物具有神经保护、抗氧化、抑制细胞毒性、抗凝等活性，可以在动脉阻塞脑缺血模型中改善脑缺血，因而可以用作开发治疗心脑血管类疾病的药物，也可以开发为神经保护和/或抗氧化和/或抗凝药物。不仅是药物，本发明脯氨酸衍生物还可以开发为治疗心脑血管疾病和/或抗凝血和/或抗氧化和/或保护神经保健品。本发明所述心脑血管类疾病包括，但不限于，缺血性脑卒中、脑梗塞、脑中风和脑动脉硬化。

下述实施方式更好地说明本发明内容。但本发明不限于下述实施例。

实施例1：N-甲基-L-脯氨酸b的合成路线如下：

将L-脯氨酸(4.0g,34.8mmol)溶于甲醇(40mL)，依次加入40％甲醛水溶液(2.8mL，38.2mmol)和10％钯碳(1g)，加毕，加氢，室温下反应24小时， 反应完全后，过滤，母液浓缩干得4g白色固体，收率89％，即为N-甲基-L-脯氨酸(化合物b)。ESI-MS：(m/z，％)＝130[M+H]⁺。

实施例2：化合物B-4的合成路线如下：

将所述N-甲基-L-脯氨酸b(1.29g,10mmol)加入二氯甲烷(20mL)，依次加入DCC(2.47g，12mmol)和甘氨酸(0.75g,10mmol)，室温下反应24小时，过滤，母液浓缩得白色固体1g，收率54％，即为化合物B-4。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ＝4.14(t,J＝8.3,1H),4.00(s,2H),3.71(ddd,J＝11.4,7.7,4.1,1H),3.22(d,J＝11.1,1H),2.95(d,J＝10.5,3H),2.58(dd,J＝12.2,7.5,1H),2.24-2.02(m,3H)。

实施例3：化合物B-5的合成路线如下：

将所述B-4(1.86g,10mmol)加入二氯甲烷(20mL)，依次加入DCC(2.47g，12mmol)和Y5(3.1g,10mmol)，室温下反应24小时，过滤，母液浓缩得无色油状物1.4g，收率30％，即为化合物B-5。ESI-MS：(m/z，％)＝480[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz,D₂O)δ＝7.43(s,2H),4.49(d,J＝7.8Hz,2H),4.42(t,J＝6.5Hz,2H),4.31(t,J＝8.5Hz,1H),3.92(s,6H),3.85-3.80(m,1H),3.31-3.25(m,3H),2.99(s,3H),2.68-2.61(m,1H),2.32–2.04(m,3H),1.94-1.84(m,2H),1.80–1.73(m,2H)。

实施例4：化合物B-6的合成路线如下：

将所述B-4(1.86g,10mmol)加入二氯甲烷(20mL)，依次加入DCC(2.47g，12mmol)和Y6(3.1g,10mmol)，室温下反应24小时，过滤，母液浓缩得无色油状物1.2g，收率25％，即为化合物B-6。ESI-MS：(m/z，％)＝479[M+H]⁺。¹H  NMR(500MHz,CD₃OD)δ＝7.33(s,2H),4.39(t,J＝6.5Hz,2H),4.13(s,2H),3.88(s,6H),3.34-3.3(m,2H),3.28(t,J＝7.0Hz,2H),2.71(m,1H),2.61(s,3H),2.36(m,1H),2.00-1.83(m,5H),1.79-1.73(m,2H)。

实施例5：测定脯氨酸衍生物对谷氨酸诱导的神经细胞损伤模型的作用

实验分组：空白对照组、模型组、阳性药组(MK-801)、供试化合物4个剂量组(1、5、10、20μmol)。

样品处理：样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内(0.1％)。

实验方法：原代大鼠小脑颗粒神经细胞完成培养后第六天加入要筛选的药物(加入96孔板时应1000倍稀释)。第七天加入浓度为200μM的谷氨酸。第八天用MTT(加入96孔板时终浓度应为0.5mg/ml)检测细胞存活率。实验结果如表1所示。

表1神经细胞存活率检测结果

由表1可见：在谷氨酸诱导神经细胞损伤模型中，化合物B‐5(20uM)、B‐6(10uM、20uM)与谷氨酸造模组相比有显著性差异，并且明显优于水苏碱，说明B-5和B-6化合物具有神经保护效果。

实施例6：测定脯氨酸衍生物对大鼠中动脉阻塞模型的药效评价

实验分组：假手术组(sham)，模型组(vehicle)，B-6，每组12-15只大鼠。

实验方法：体重250-280g的SD雄性大鼠，线栓法形成中动脉阻塞脑缺血模型，于缺血后2h、4h、6h尾静脉注射给药，24h后检测鼠脑梗死面积以及神经行为学评分指标。实验结果如表2、3和图1所示。

表2脑梗死面积(梗死面积/总体积)

表3神经行为学评分(分)

结果显示：化合物B-6能够显著减少大鼠短暂性脑缺血造成的脑梗死面积并降低大鼠短暂性脑缺血后的神经行为学评分。说明B-6化合物具备显著的抗缺血性脑卒中活性。

急性毒性试验显示B-6在对大鼠的半数致死剂量为85mg/kg，由于活性剂量在1mg/kg，因而认为B-6具有可观的治疗窗口。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。