BUFFER SYSTEM AND METHOD OF USING THE BUFFER SYSTEM TO MEASURE TOTAL ALKALOID IN TOBACCO OR TOBACCO PRODUCTS THROUGH CONTINUOUS FLOW

本发明属于烟草化学成分检测技术领域，具体涉及一种缓冲体系及采用该缓冲体系以连续流动法测定烟草或烟草制品中总植物碱的方法。

烟碱是烟草的重要成分，无烟碱也就称不上烟草。在烟草常规分析中，通常通过测定烟草中总植物碱的含量来获知烟碱的含量信息。烟草行业目前发布的关于烟草中总植物碱测定的标准有：GB/T23225-2008“烟草及烟草制品总植物碱的测定光度法”、YC/T160-2002“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法”以及YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”。

连续流动法属于仪器分析方法，适合大批量进样，目前应用较为广泛。YC/T160-2002“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法”的测定原理是采用氰化钾和氯胺T在线生成氯化氰，使烟碱的吡啶环断开，进而与对氨基苯磺酸发生反应，反应产物在460nm波长处用比色计进行测定。氰化钾虽然较为稳定，但它是一种剧毒的物质，位于有毒化学品前列。对于氰化钾的使用，存在诸多顾忌，其销售渠道把关很严，很多实验室购买周期很长甚至无法买到，使用者还需要在公安机关备案等等。由于该方法对反应适宜的酸碱环境有要求，因此该方法是通过缓冲溶液A和缓冲溶液B来控制反应的酸碱环境。在该方法中由于缓冲溶液B的缓冲能力不强，如一些化学分析实验室用水的pH在5.0～6.0之间，该缓冲溶液B的缓冲能力达不到测试需要。该方法实际使用水的pH要求要高于GB6682/T-2008“分析实验室用水规格和试验方法”中一级水的要求，为了达到该方法的用水要求，化学分析实验室需要对一级水进行再处理，使该方法实际使用具有一定的局限性。

YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”的测定原理是采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠在线生成氯化氰，使烟碱的吡啶环断开，进而与对氨基苯磺酸发生反应，反应产物在460nm波长处用比色计进行测定。相较于YC/T160-2002，YC/T 468-2013不使用氰化钾，提高了总植物碱测定的操作安全性。在YC/T 468-2013中对反应适宜的酸碱环境也有要求，同样是通过缓冲溶液A和缓冲溶液B来控制反应的酸碱环境，虽然能够有效控制反应的酸碱环境，但是该方法缓冲溶液A和缓冲溶液B配制时化学品用量较大，同样对该方法的使用带来不便。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种新的缓冲体系以及采用该缓冲体系以连续流动法测定烟草或烟草制品中总植物碱的方法。该缓冲体系适用于采用连续流动(硫氰酸钾)法测定烟草及烟草制品中的总植物碱。采用本发明的缓冲体系在减少了配制时化学品的使用量的同时能控制反应的酸碱环境，保证氯化氰使植物碱的吡啶环断裂，进而与对氨基苯磺酸的反应，使反应在需要的酸碱环境条件下进行，采用该缓冲体系在减少使用量的同时保证了同YC/T 468-2013方法测试结果的一致性。

本发明是采用如下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种适用于连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的缓冲体系，该缓冲体系包含缓冲溶液A和缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠60.5-83.0g，优选为71.6g；磷酸三钠10.1-20.2g，优选为15.2g至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；

缓冲溶液B的配制为：称取对氨基苯磺酸5.5-8.0g，优选为7.0g；磷酸氢二钠60.5-83.0g，优选为71.6g；磷酸二氢钠5.0-7.0g，优选为6.2g和柠檬酸钠10.0-12.1g，优选为11.8g至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

上述的磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠可以为常规存在形式，例如磷酸氢二钠以12个结晶水形式存在，磷酸三钠以12个结晶水形 式存在，磷酸二氢钠以2个结晶水形式存在，柠檬酸钠以2个结晶水形式存在。

优选地，在上述缓冲体系中，缓冲溶液A与缓冲溶液B之间的用量比为1：2至1：1(体积比)，优选为3：4(体积比)。

另一方面，一种用连续流动法测定烟草或烟草制品中总植物碱的方法，该方法采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠在线生成氯化氰，氯化氰与所述烟草或烟草制品中的总植物碱(以烟碱计)反应，使烟碱的吡啶环断开，进而与对氨基苯磺酸发生反应，反应产物用比色计在460nm处测定，该方法包括：

采用缓冲溶液A和缓冲溶液B将反应体系的pH值控制在6.0～7.5之间；

其中，缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠60.5-83.0g，优选为71.6g；磷酸三钠10.1-20.2g，优选为15.2g至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；

缓冲溶液B的配制为：称取对氨基苯磺酸5.5-8.0g，优选为7.0g；磷酸氢二钠60.5-83.0g，优选为71.6g；磷酸二氢钠5.0-7.0g，优选为6.2g和柠檬酸钠10.0-12.1g，优选为11.8g至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

上述的磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠可以为常规存在形式，例如磷酸氢二钠以12个结晶水形式存在，磷酸三钠以12个结晶水形式存在，磷酸二氢钠以2个结晶水形式存在，柠檬酸钠以2个结晶水形式存在。

优选地，上述方法中，缓冲溶液A与缓冲溶液B的用量比为1：2至1：1(体积比)，优选为3：4(体积比)；

优选地，上述方法还包括：

样品的制备为：按YC/T31制备烟草试样，并测定其水分含量，然后使用5％醋酸对烟草试样进行萃取，过滤，得滤液。

优选地，上述方法还包括：

标准溶液的配制为：

称取烟碱或烟碱盐以5％的醋酸溶解，配制成至少5个工作标准液，所配制的标准溶液中烟碱含量浓度范围为0.5～7％；

优选地，上述方法还包括：

解毒液A的配制为：称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；该解毒液A的主要作用是降低未参与反应的氯化氰的毒性，该解毒液A与YC/T160-2002(氰化钾法)中的解毒液A相同。

解毒液B的配制为：称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；该解毒液B的主要作用是降低未参与反应的氯化氰的毒性，该解毒液B与YC/T160-2002(氰化钾法)解毒液B相同。

硫氰酸钾溶液的配制为：称取硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容，该溶液浓度范围为0.09～0.21mol/L，优选为0.12mol/L。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：称取二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容，该溶液浓度范围为0.02～0.06mol/L，优选为0.04mol/L。

优选地，上述方法中，硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液浓度比为2.5：1至3.5：1，优选为3：1。

优选地，上述方法还包括：

使用连续流动分析仪进行检测，然后根据下式计算样品中的总植物碱：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

上式计算的总植物碱为以干基计的总植物碱的含量。

优选地，上述方法中，连续流动分析仪的运行参数为：进样清洗比为1.5，进样频率48杯/小时，增益18-60，光强2.85伏。

优选地，上述方法包括：

(1)样品的制备：按YC/T31制备烟草试样，并测定其水分含量，然后使用5％醋酸对烟草试样进行萃取，过滤，得滤液备用；(2)标准溶液的配制：

称取烟碱或烟碱盐以5％的醋酸溶解，配制成至少5个工作标准液，所配制的标准溶液中烟碱含量浓度范围为0.5～7％；

(3)反应试剂的配制：

硫氰酸钾溶液的配制为：称取硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容，该溶液浓度范围为0.09～0.21mol/L，优选为0.12mol/L。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：称取二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容，该溶液浓度范围为0.02～0.06mol/L，优选为0.04mol/L。

缓冲溶液A的配制：称取磷酸氢二钠60.5-83.0g，优选为71.6g、磷酸三钠10.1-20.2g，优选为15.2g至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；

缓冲溶液B的配制：称取对氨基苯磺酸5.5-8.0g，优选为7.0g；磷酸氢二钠60.5-83.0g，优选为71.6g；磷酸二氢钠5.0-7.0g，优选为6.2g和柠檬酸钠10.0-12.1g，优选为11.8g至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；

上述的磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠可以为常规存在形式，例如磷酸氢二钠以12个结晶水形式存在，磷酸三钠以12个结晶水形式存在，磷酸二氢钠以2个结晶水形式存在，柠檬酸钠以2个结晶水形式存在。

解毒液A的配制为：称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；该解毒液A的主要作用是降低未参与反应的氯化氰的毒性，该解毒液A与YC/T160-2002(氰化钾法)中的解毒液A相同。

解毒液B的配制为：称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度；该解毒液B的主要作用是降低未参与反应的氯化氰的毒性，该解毒液B与YC/T160-2002(氰化钾法)解毒液B相同。

(4)使用连续流动分析仪在步骤(3)的反应体系下检测步骤(1)的滤液和步骤(2)的工作标准液；

(5)根据下式计算样品中的总植物碱：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

优选地，上述方法中，缓冲溶液A与缓冲溶液B的用量比为1：2至1：1(体积比)，优选为3：4(体积比)，该用量比使得反应体系的pH值控制在6.0～7.5之间；

优选地，上述方法中，硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液浓度比为2.5：1至3.5：1，优选为3：1。

优选地，上述方法中，连续流动分析仪的运行参数为：进样清洗比为1.5，进样频率48杯/小时，增益18-60，光强2.85伏。

在上述方法中，样品的制备、标准溶液的配制、反应试剂的配制顺序可以变化。

在一个具体实施方案中，本发明的方法具体步骤如下：

(1)使用5％醋酸萃取烟末试样(烟末试样按YC/T 31来制备)中的总植物碱；

(2)按照图1所示连接管路：

(3)配置一定浓度的缓冲溶液A和B、解毒液A、解毒液B、硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液；

(4)使用5％醋酸配制总植物碱标准溶液；

(5)将总植物碱模块上的泵管按照图1所示卡入蠕动泵(模块上不同泵管的内径不同，对应的试剂的流速不同，通过控制反应试剂的流速来达到控制参与反应试剂比例的目的；加入空气泵管是为了使管路中的溶液混合均匀)，将泵盖盖上，将试剂管放入水中；打开电源，打开检测器，蠕动泵，自动进样器，计算机；将蠕动泵上的开关拨至Run；双击计算机中连接连续流动分析工作站图标；点击工作站上的charting，连接成功后，蠕动泵运行，水就被泵入管路中清洗，清洗时间为20～30min；待基线稳定(此时基线波动小于±1％)后，将不同的管路放入所对应的试剂中，继续运行，期间在工作站所弹出的charting窗口中调节基线至5％左右；按照工作站的下拉菜单中Analysis的提示编制运行程序，待基线稳定，点击工作站中的Run即 可运行；待程序运行结束，将不同的管路重新放回水中，清洗20～30min；清洗完成后，依次关闭自动进样器，蠕动泵，检测器，将泵盖取下，关闭电源。

上述步骤(1)具体为：称取烟末试样(烟末试样按YC/T 31来制备)至50mL具塞三角瓶中，加入5％醋酸振荡30min，使用定性滤纸过滤。

上述步骤(2)具体为：按照图1所示，将泵管安装在蠕动泵上，加上泵盖，用水清洗管路。

上述步骤(3)中，缓冲溶液A的配制为：称取71.6克的磷酸氢二钠、15.2克的磷酸三钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。其中，磷酸氢二钠、磷酸三钠可以为常规存在形式，例如磷酸氢二钠以12个结晶水形式存在，磷酸三钠以12个结晶水形式存在。

上述步骤(3)中，缓冲溶液B的配制为：称取7g对氨基苯磺酸、71.6克磷酸氢二钠、6.2克磷酸二氢钠和11.8克柠檬酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。其中，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠可以为常规存在形式，例如磷酸氢二钠以12个结晶水形式存在，磷酸二氢钠以2个结晶水形式存在，柠檬酸钠以2个结晶水形式存在。

上述步骤(3)中，解毒液A的配制为：称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。解毒液A的主要作用是降低未参与反应氯化氰的毒性。步骤(3)中解毒液A与YC/T160-2002(氰化钾法)解毒液A相同。

上述步骤(3)中解毒液B的配制为：称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。解毒液B的主要作用是降低未参与反应氯化氰的毒性。步骤(3)中解毒液B与YC/T160-2002(氰化钾法)解毒液B相同。

上述步骤(3)中，硫氰酸钾溶液的配制为：称取适量硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容。该溶液浓度范围为0.09～0.21mol/L。

上述步骤(3)中，二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：称取适量二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容。该溶液浓度范围为0.02～0.06mol/L。

上述步骤(3)中，硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液浓度配比约为3： 1。

上述步骤(4)中，标准溶液配制为：称取适量烟碱于250mL容量瓶中，用5％醋酸溶解，定容至刻度。此溶液为烟碱储备液，烟碱含量约1.6mg/mL左右。由烟碱储备液制备至少5个工作标准液，其浓度范围应覆盖预计检测到的样品含量。

上述步骤(5)中，连续流动分析仪的运行参数为：进样清洗比为1.5，进样频率48杯/小时，增益18-60，光强2.85伏。

上述连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱中，样品前处理与YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”一致，改变了缓冲溶液A和缓冲溶液B，建立了一种新的缓冲体系，减少配制缓冲溶液A和缓冲溶液B时化学品的使用量，同时保证了同YC/T468-2013方法测试结果的一致性。

本发明至少存在以下有益效果：

本发明采用一种新的缓冲溶液A能控制渗析器前反应的酸碱环境，保证渗析器前溶液pH值在6.0～11.0之间并不会对缓冲溶液B控制的酸碱环境造成影响；

本发明采用一种新的缓冲溶液B能控制反应的酸碱环境，调节溶液pH值在6.0～7.5之间，保证氯化氰使植物碱的吡啶环断裂，进而与对氨基苯磺酸的反应，在反应需要的酸碱环境条件下进行；

本发明建立了一种新的适用于连续流动(硫氰酸钾)法测定烟草及烟草制品中总植物碱的缓冲体系；

采用本发明的缓冲体系的连续流动法与YC/T 468-2013相比，减少了配制缓冲溶液A和缓冲溶液B时化学品的使用量，同时保证数据与YC/T468-2013一致。

图1为采用本发明的缓冲体系的连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的管路图。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。这些实施例旨在帮助阐述发 明的内容而不是限制本发明的范围。

实施例1：烤烟中总植物碱的测定

1)样品前处理

将烤烟烟末按照YC/T31制备成试样，并测定其水分含量，然后称取0.25g试样于50mL具塞三角瓶中，加入25mL5％醋酸，盖上塞子，在振荡器上振荡(转速>150rpm)萃取30min。用快速定性滤纸过滤萃取液，弃去前2mL～3mL滤液，收集后续滤液作分析之用。

2)反应试剂的配制

缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠(12个结晶水)60.5克、磷酸三钠(12个结晶水)12.2克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

缓冲溶液B的配制为：称取5.5g对氨基苯磺酸、磷酸氢二钠(12个结晶水)60.5克、磷酸二氢钠(2个结晶水)5.0克和柠檬酸钠(2个结晶水)10.0克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

在以下测定时，缓冲溶液A和缓冲溶液B的用量比为3：4(体积比)。

解毒液A、解毒液B、硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液的配制与YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”中对应试剂相同。

具体如下：

解毒溶液A的配制为：

称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

解毒溶液B的配制为：

称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

硫氰酸钾溶液的配制为：

称取2.88g硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：

称取2.20g二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容 量瓶中，用水定容至刻度。该溶液应现配现用。

3)标准溶液的配制

称取适量总植物碱标液(国家烟草质量监督检验中心，有证标物)于250mL容量瓶中，精确至0.0001g，用水溶解，定容至刻度，此溶液为烟碱标准储备液，烟碱含量应在1.6mg/mL左右。分别移取12.5mL、10mL、5mL、2.5mL、0.5mL烟碱标准储备液至100mL容量瓶中，用5％的醋酸定容，得到工作标液的浓度分别为1.2105mg/mL、0.9683mg/mL、0.4842mg/mL、0.2421mg/mL、0.0484mg/mL。

4)本发明中所使用的分析仪器为德国布朗卢比公司生产的AA3型连续流动分析仪。采用连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的管路如图1所示。将总植物碱模块上的泵管按照图1所示卡入蠕动泵(模块上不同泵管的内径不同，对应的试剂的流速不同，通过控制反应试剂的流速来达到控制参与反应试剂比例的目的；加入空气泵管是为了使管路中的溶液混合均匀)，将泵盖盖上，将试剂管放入水中；打开电源，打开检测器，蠕动泵，自动进样器，计算机；将蠕动泵上的开关拨至Run，双击连接连续流动分析工作站；点击工作站上的charting，连接成功后，蠕动泵运行，水就被泵入管路中清洗，清洗时间为20～30min；待基线稳定(此时基线波动小于±1％)后，将不同的管路放入所对应的试剂中，继续运行，期间在工作站所弹出的charting窗口中调节基线至5％左右；按照工作站的下拉菜单中Analysis的提示编制运行程序，待基线稳定，点击工作站中的Run即可运行；待程序运行结束，将不同的管路重新放回水中，清洗20～30min；清洗完成后，依次关闭自动进样器，蠕动泵，检测器，将泵盖取下，关闭电源。

5)标准曲线采用一次曲线；

6)数据计算

总植物碱峰的峰高对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。然后通过检测样品的峰高，由标准曲线得到样品对应的浓度，即仪器观测值。

以干基计的总植物碱含量，由下式得出：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(此处萃取液体积为 25mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

由以上公式算出烤烟中总植物碱含量为0.5～3％。

实施例2：白肋烟中总植物碱的测定

1)样品前处理

将白肋烟烟末按照YC/T31制备成试样，并测定其水分含量，然后称取0.25g白肋烟试样于50mL具塞三角瓶中，加入25mL5％醋酸，盖上塞子，在振荡器上振荡(转速>150rpm)萃取30min。用快速定性滤纸过滤萃取液，弃去前2mL～3mL滤液，收集后续滤液作分析之用。

2)反应试剂的配制

缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠(12个结晶水)83.0克、磷酸三钠(12个结晶水)18.4克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

缓冲溶液B的配制为：称取8.0g对氨基苯磺酸、磷酸氢二钠(12个结晶水)83.0克、磷酸二氢钠(2个结晶水)7.0克和柠檬酸钠(2个结晶水)12.1克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

在以下测定时，缓冲溶液A和缓冲溶液B的用量比为请补充3：4(体积比)。

解毒液A、解毒液B、硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液的配制与YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”中对应试剂相同。

具体如下：

解毒溶液A的配制为：

称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

解毒溶液B的配制为：

称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

硫氰酸钾溶液的配制为：

称取2.88g硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：

称取2.20g二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液应现配现用。

3)标准溶液的配制

称取适量总植物碱标液(国家烟草质量监督检验中心，有证标物)于250mL容量瓶中，精确至0.0001g，用水溶解，定容至刻度，此溶液为烟碱标准储备液，烟碱含量应在1.6mg/mL左右。分别移取12.5mL、10mL、5mL、2.5mL、0.5mL烟碱标准储备液至100mL容量瓶中，用5％的醋酸定容，得到工作标液的浓度分别为1.2105mg/mL、0.9683mg/mL、0.4842mg/mL、0.2421mg/mL、0.0484mg/mL。

4)本发明中所使用的分析仪器为德国布朗卢比公司生产的AA3型连续流动分析仪。采用连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的管路如图1所示。将总植物碱模块上的泵管按照图1所示卡入蠕动泵(模块上不同泵管的内径不同，对应的试剂的流速不同，通过控制反应试剂的流速来达到控制参与反应试剂比例的目的；加入空气泵管是为了使管路中的溶液混合均匀)，将泵盖盖上，将试剂管放入水中；打开电源，打开检测器，蠕动泵，自动进样器，计算机；将蠕动泵上的开关拨至Run，双击连接连续流动分析工作站；点击工作站上的charting，连接成功后，蠕动泵运行，水就被泵入管路中清洗，清洗时间为20～30min；待基线稳定(此时基线波动小于±1％)后，将不同的管路放入所对应的试剂中，继续运行，期间在工作站所弹出的charting窗口中调节基线至5％左右；按照工作站的下拉菜单中Analysis的提示编制运行程序，待基线稳定，点击工作站中的Run即可运行；待程序运行结束，将不同的管路重新放回水中，清洗20～30min；清洗完成后，依次关闭自动进样器，蠕动泵，检测器，将泵盖取下，关闭电源。

5)标准曲线采用一次曲线；

6)数据计算

总植物碱峰的峰高对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。然后通过检测样品的峰高，由标准曲线得到样品对应的浓度，即仪器观测值。

以干基计的总植物碱含量，由下式得出：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(此处萃取液体积为25mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

由以上公式算出白肋烟中总植物碱含量为1～6％。

实施例3：烤烟中总植物碱的测定

1)样品前处理

将烤烟烟末按照YC/T31制备成试样，并测定其水分含量，然后称取0.25g试样于50mL具塞三角瓶中，加入25mL5％醋酸，盖上塞子，在振荡器上振荡(转速>150rpm)萃取30min。用快速定性滤纸过滤萃取液，弃去前2mL～3mL滤液，收集后续滤液作分析之用。

2)反应试剂的配制

缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠(12个结晶水)71.6克、磷酸三钠(12个结晶水)15.2克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

缓冲溶液B的配制为：称取7g对氨基苯磺酸、磷酸氢二钠(12个结晶水)71.6克、磷酸二氢钠(2个结晶水)6.2克和柠檬酸钠(2个结晶水)11.8克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容用水定容至刻度。

在以下测定时，缓冲溶液A和缓冲溶液B的用量比为3：4(体积比)。

解毒液A、解毒液B、硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液的配制与YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”中对应试剂相同。

具体如下：

解毒溶液A的配制为：

称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

解毒溶液B的配制为：

称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

硫氰酸钾溶液的配制为：

称取2.88g硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：

称取2.20g二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液应现配现用。

3)标准溶液的配制

称取适量总植物碱标液(国家烟草质量监督检验中心，有证标物)于250mL容量瓶中，精确至0.0001g，用水溶解，定容至刻度，此溶液为烟碱标准储备液，烟碱含量应在1.6mg/mL左右。分别移取12.5mL、10mL、5mL、2.5mL、0.5mL烟碱标准储备液至100mL容量瓶中，用5％的醋酸定容，得到工作标液的浓度分别为1.2105mg/mL、0.9683mg/mL、0.4842mg/mL、0.2421mg/mL、0.0484mg/mL。

4)本发明中所使用的分析仪器为德国布朗卢比公司生产的AA3型连续流动分析仪。采用连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的管路如图1所示。将总植物碱模块上的泵管按照图1所示卡入蠕动泵(模块上不同泵管的内径不同，对应的试剂的流速不同，通过控制反应试剂的流速来达到控制参与反应试剂比例的目的；加入空气泵管是为了使管路中的溶液混合均匀)，将泵盖盖上，将试剂管放入水中；打开电源，打开检测器，蠕动泵，自动进样器，计算机；将蠕动泵上的开关拨至Run，双击连接连续流动分析工作站；点击工作站上的charting，连接成功后，蠕动泵运行，水就被泵入管路中清洗，清洗时间为20～30min；待基线稳定(此时基线波动小于±1％)后，将不同的管路放入所对应的试剂中，继续运行，期间在工作站所弹出的charting窗口中调节基线至5％左右；按照工作站的下拉菜单中Analysis的提示编制运行程序，待基线稳定，点击工作站中的Run即可运行；待程序运行结束，将不同的管路重新放回水中，清洗20～30min；清洗完成后，依次关闭自动进样器，蠕动泵，检测器，将泵盖取下，关闭电源。

5)标准曲线采用一次曲线；

6)数据计算

总植物碱峰的峰高对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。然后通过检测样品的峰高，由标准曲线得到样品对应的浓度，即仪器观测值。

以干基计的总植物碱含量，由下式得出：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(此处萃取液体积为25mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

由以上公式算出烤烟中总植物碱含量为0.5～3％。

实施例4：白肋烟中总植物碱的测定

1)样品前处理

将白肋烟烟末按照YC/T31制备成试样，并测定其水分含量，然后称取0.25g白肋烟试样于50mL具塞三角瓶中，加入25mL5％醋酸，盖上塞子，在振荡器上振荡(转速>150rpm)萃取30min。用快速定性滤纸过滤萃取液，弃去前2mL～3mL滤液，收集后续滤液作分析之用。

2)反应试剂的配制

缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠(12个结晶水)71.6克、磷酸三钠(12个结晶水)15.2克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

缓冲溶液B的配制为：称取7g对氨基苯磺酸、磷酸氢二钠(12个结晶水)71.6克、磷酸二氢钠(2个结晶水)6.2克和柠檬酸钠(2个结晶水)11.8克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容用水定容至刻度。

在以下测定时，缓冲溶液A和缓冲溶液B的用量比为请补充3：4(体积比)。

解毒液A、解毒液B、硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液的配制与YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”中对应试剂相同。

具体如下：

解毒溶液A的配制为：

称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

解毒溶液B的配制为：

称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

硫氰酸钾溶液的配制为：

称取2.88g硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：

称取2.20g二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液应现配现用。

3)标准溶液的配制

称取适量总植物碱标液(国家烟草质量监督检验中心，有证标物)于250mL容量瓶中，精确至0.0001g，用水溶解，定容至刻度，此溶液为烟碱标准储备液，烟碱含量应在1.6mg/mL左右。分别移取12.5mL、10mL、5mL、2.5mL、0.5mL烟碱标准储备液至100mL容量瓶中，用5％的醋酸定容，得到工作标液的浓度分别为1.2105mg/mL、0.9683mg/mL、0.4842mg/mL、0.2421mg/mL、0.0484mg/mL。

4)本发明中所使用的分析仪器为德国布朗卢比公司生产的AA3型连续流动分析仪。采用连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的管路如图1所示。将总植物碱模块上的泵管按照图1所示卡入蠕动泵(模块上不同泵管的内径不同，对应的试剂的流速不同，通过控制反应试剂的流速来达到控制参与反应试剂比例的目的；加入空气泵管是为了使管路中的溶液混合均匀)，将泵盖盖上，将试剂管放入水中；打开电源，打开检测器，蠕动泵，自动进样器，计算机；将蠕动泵上的开关拨至Run，双击连接连续流动分析工作站；点击工作站上的charting，连接成功后，蠕动泵运行，水就被泵入管路中清洗，清洗时间为20～30min；待基线稳定(此时基线波动小于±1％)后，将不同的管路放入所对应的试剂中，继续运行，期间在工作站所弹出的charting窗口中调节基线至5％左右；按照工作站的下拉菜单中Analysis的提示编制运行程序，待基线稳定，点击工作站中的Run即可运行；待程序运行结束， 将不同的管路重新放回水中，清洗20～30min；清洗完成后，依次关闭自动进样器，蠕动泵，检测器，将泵盖取下，关闭电源。

5)标准曲线采用一次曲线；

6)数据计算

总植物碱峰的峰高对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。然后通过检测样品的峰高，由标准曲线得到样品对应的浓度，即仪器观测值。

以干基计的总植物碱含量，由下式得出：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(此处萃取液体积为25mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

由以上公式算出白肋烟中总植物碱含量为1～5％。

实施例5：卷烟中总植物碱的测定

1)样品前处理

将卷烟烟丝按照YC/T31制备成试样，并测定其水分含量，然后称取0.25g卷烟试样于50mL具塞三角瓶中，加入25mL5％醋酸，盖上塞子,在振荡器上振荡(转速>150rpm)萃取30min。用快速定性滤纸过滤萃取液，弃去前2mL～3mL滤液，收集后续滤液作分析之用。

2)反应试剂的配制

缓冲溶液A的配制为：称取磷酸氢二钠(12个结晶水)71.6克、磷酸三钠(12个结晶水)15.2克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

缓冲溶液B的配制为：称取7g对氨基苯磺酸、磷酸氢二钠(12个结晶水)71.6克、磷酸二氢钠(2个结晶水)6.2克和柠檬酸钠(2个结晶水)11.8克至烧杯中，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，用水定容至刻度。

在以下测定时，缓冲溶液A和缓冲溶液B的用量比为3：4(体积比)

解毒液A、解毒液B、硫氰酸钾溶液和二氯异氰尿酸钠溶液的配制与 YC/T 468-2013“烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动(硫氰酸钾)法”中对应试剂相同。

具体如下：

解毒溶液A的配制为：

称取1g柠檬酸、10g硫酸亚铁至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

解毒溶液B的配制为：

称取10g碳酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。

硫氰酸钾溶液的配制为：

称取2.88g硫氰酸钾至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。

二氯异氰尿酸钠溶液的配制为：

称取2.20g二氯异氰尿酸钠至烧杯中，用水溶解，然后转入250mL容量瓶中，用水定容至刻度。该溶液应现配现用。

3)标准溶液的配制

称取适量总植物碱标液(国家烟草质量监督检验中心，有证标物)于250mL容量瓶中，精确至0.0001g，用水溶解，定容至刻度，此溶液为烟碱标准储备液，烟碱含量应在1.6mg/mL左右。分别移取12.5mL、10mL、5mL、2.5mL、0.5mL烟碱标准储备液至100mL容量瓶中，用5％的醋酸定容，得到工作标液的浓度分别为1.2105mg/mL、0.9683mg/mL、0.4842mg/mL、0.2421mg/mL、0.0484mg/mL。

4)本发明中所使用的分析仪器为德国布朗卢比公司生产的AA3型连续流动分析仪。采用连续流动法测定烟草及烟草制品中总植物碱的管路如图1所示。将总植物碱模块上的泵管按照图1所示卡入蠕动泵(模块上不同泵管的内径不同，对应的试剂的流速不同，通过控制反应试剂的流速来达到控制参与反应试剂比例的目的；加入空气泵管是为了使管路中的溶液混合均匀)，将泵盖盖上，将试剂管放入水中；打开电源，打开检测器，蠕动泵，自动进样器，计算机；将蠕动泵上的开关拨至Run，双击连接连续流动分析工作站；点击工作站上的charting，连接成功后，蠕动泵运行，水就被泵入管路中清洗，清洗时间为20～30min；待基线稳定(此时基线波动小于±1％)后，将 不同的管路放入所对应的试剂中，继续运行，期间在工作站所弹出的charting窗口中调节基线至5％左右；按照工作站的下拉菜单中Analysis的提示编制运行程序，待基线稳定，点击工作站中的Run即可运行；待程序运行结束，将不同的管路重新放回水中，清洗20～30min；清洗完成后，依次关闭自动进样器，蠕动泵，检测器，将泵盖取下，关闭电源。

5)标准曲线采用一次曲线；

6)数据计算

总植物碱峰的峰高对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。然后通过检测样品的峰高，由标准曲线得到样品对应的浓度，即仪器观测值。

以干基计的总植物碱含量，由下式得出：

式中，X：样品的仪器观测值，单位毫克每毫升(mg/mL)；

V：加入的萃取液体积，单位为毫升(此处萃取液体积为25mL)；

m：样品质量，单位为克(g)；

W：试样的水分百分含量，％(质量分数)；

由以上公式算出卷烟中总植物碱含量为0.5～4％。

实施例6：采用本发明缓冲体系的连续流动法与采用其他缓冲体系的连续流动法检测结果的对比研究

如无特殊说明，本实施例使用的试剂及方法均与YC/T 468-2013相一致。

分别采用本发明实施例1、实施例2和实施例3-5使用的缓冲体系对烤烟，白肋烟，香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟五种样品进行测定，其测定结果见表1～表3。从表1～表3可知：同一样品采用本发明(实施例1、实施例2和实施例3-5使用)缓冲体系的连续流动法测定结果和YC/T 468-2013方法的测定结果进行配对t检验(α＝0.05)，结果，采用本发明缓冲体系的连续流动法结果为P_实施例1＝0.85>0.05、P_实施例2＝0.92>0.05、P_实施例3-5＝0.35>0.05，说明两种分析方法没有显著性差异，表明采用本发明缓冲体系的连续流动法与YC/T 468-2013标准方法结果一致；在本发明实施例1、实施例2和实施例3-5使用的缓冲体系中，实施例3-5使用的缓冲体系与 YC/T 468-2013标准方法结果差值最小，为优选的条件。

表1采用本发明缓冲体系(实施例1中使用)的连续流动法与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表2采用本发明缓冲体系(实施例2中使用)的连续流动法与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表3采用本发明缓冲体系(实施例3-5中使用)的连续流动法与YC/T 468-2013方法测定结果比对

此外，发明人还采用其他缓冲体系(除缓冲体系与本发明不同之外，其余试剂与本发明的实施例3～5相同)对烤烟，白肋烟，香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟五种样品进行测定，其测定结果见表4～表9。从表4～表9可知：采用其他缓冲体系测定结果相对于YC/T 468-2013方法的绝对差值均较大。在表10中列出了对同一样品分别采用本发明缓冲体系(本发明的实施例3-5中使用的缓冲溶液A和缓冲溶液B，缓冲溶液A和缓冲溶液B的用量比与实施例3-5相同)的连续流动法、其他缓冲体系的连续流动法和YC/T 468-2013方法的测定结果进行配对t检验(α＝0.05)，结果，采用本发明缓冲体系的连续流动法结果为P_实施例3-5＝0.35>0.05，说明两种分析方法没有显著性差异，表明采用本发明缓冲体系的连续流动法与YC/T 468-2013标准方法结果一致；采用其他缓冲体系的检测方法P<0.05，说明这些分析方法存在显著性差异，表明采用其他缓冲体系的方法与YC/T 468-2013标准方法测试结果不一致。

表4磷酸氢二钠、硼砂体系与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表5磷酸二氢钠、氢氧化钠体系与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表6磷酸钠、柠檬酸体系与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表7柠檬酸钠、柠檬酸体系与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表8巴比妥纳、盐酸体系与YC/T 468-2013方法测定结果比对

表9三羟甲基氨基甲烷、盐酸体系与YC/T 468方法测定结果比对

表10不同缓冲体系与YC/T 468-2013方法测定结果配对t检验