LANTHANIDE-BINDER COMPLEX, METHOD FOR PRODUCING THE LANTHANIDE-BINDER COMPLEXES, BINDERS DERIVED FROM DIPICOLINIC ACID, AND USE OF THE LANTHANIDE-BINDER COMPLEXES

COMPLEXOS IANTANÍDEO-LIGANTTES; PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS COMPLEXOS LANTANÍDEO-LIGANTES; LIGANTES DERIVADOS DO ÁCIDO DIPICOLÍNICO; E, USOS DOS COMPLEXOS LANTANÍDEO-LIGANTES CAMPO DA INVENÇÃO

h presente invenção pertence ao campo da química de ligantes orgânicos e compostos de coordenação, especif icadamente de complexos d« larvtanideos, seus processos de obtenção e usos.

ESTADO DA TÉCNICA

O câncer é uma das patologias que mais preocupam a saúde pública mundial (NAGAHARA et ai., 2010). Segundo relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARO/OMS, o impacto global dessa doença, mais que dobrou nos últimos 30 anos. Estatísticas mundiais demonstraram que no ano de 2008 advieram aproximadamente 12 milhões de casos novos core 7,6 milhões de óbitos (WHO, 2009). No Brasil, as estimativas para o ano de 2010/2011 demonstraram que ocorreram aproximadamente 489.270 casos novos/ano, sendo a segunda principal doença com causa mortis conhecida (Inca, 2009) .

Dentre os principais tumores estudados destaca-se o giiobiastoma multiforme (LIU et al., 2014) e o carcinoma de pâncreas (Inca, 2014), devido á sua agressividade e alta taxa de mortalidade.

Assim, os gliomas são os tumores primários mais diagnosticados no sistema nervoso central (Liu et ai., 2014) . De acordo com a sua origem podemos dividi-las em astroeitomas, cligodendrogliomas, e oligoastrocitomas (LOUIS et al., 2007; OHGAKI et al., 2003; HELLER, 2011; LIU et al., 2014) . Sendo que, os astrocitomas sSo os mais frequentemente encontrados em pacientes na idade adulta ( POLEDNAK et al . , 1395a; WYBRANSKA et al., 2013}.

Já o carcinoma de pâncreas è o tipo de câncer mais comum neste órgão, atingindo 90% de todos os casos (Inca, 2014) . Anualmente, corresponde à 5* causa de morte por malignidade no ocidente. Dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) o colocaram como 2% de todos os tipos de câncer e 4% do total de mortes por câncer. É alta a taxa de mortalidade devido ao diagnóstico tardio e pela sua característica extremamente agressiva. A sobrevida média sm

5 anos é menor que 0,4%, após o diagnóstico o tempo de vida em média é de 4 a 6 meses. Se o tumor é operével a sobrevida de vida média em S anos é menor que 20%, e em. média de 13 a 20 meses de vida após a cirurgia (Inca, 2014) . Atualmente as principais metodologias curativas sáo a resseccêo cirúrgica, a quimioterapia e a radioterapia (Inca, 20X4).

(6] Portanto novos tratamentos ou diagnósticos para esses dois tipos tumorais sâo benvindos e saudados cientificamente. Dentre as novas metodologias empregadas destaea-se a utilização de complexos de lantan.ídeos . Complexos com lantanideos são utilizados como ferramenta diagnostica em exames para ressonância magnética nuclear (ANTUNES et al., 2008) . Como apresentam alto valor comercial, a busca por novos ligantes capazes de se ligar a regiões especificas é de grande interesse industrial e comercial.

Dentre as várias aplicações dos materiais contendo ions lantanideos destaca-se a aplicação como marcadores luminescentes em sistemas biológicos (MARTINS et al,, 2005).

6 possibilidade de utilização de marcadores luminescentes para. sistemas biológicos com certo grau de especificidade sempre foi alvo de inúmeros grupos de pesquisa, pois permite o rastreamento ou marcação de determinada proteína ou organela que se deseja estudar ou monitorar (MARTINS et al.f 2005) .

Para o sucesso de um marcador biológico este deve adentrar no meio celular, ou seja, atravessar a membrana celular sem prejuiaos á mesma e, dependendo do que se deseja, não interagir com uma organela em específico. Complexos pequenos, sem oarga e coro caráter lipofilico têm asais chances de atravessar a membrana celular, geralmente complexos com grupos ionizáveis (por exemplo -COOH) só conseguem adentrar na célula através de difusão facilitada ou encíccitose ÍRAJENDRAN; YAP2CI; M2LLER, 2014) . Uma outra estratégia utilizada para garantir ave o complexo adentre no meio celular è ancorá-lo em algum tipo de substrato que possua maior facilidade de adentrar no meie celular carregando o complexo. Porém o que se busca é que o complexo possa adentrar sem a necessidade de um tratamento prévio.

Uma vez o complexo dentro da célula este deve interagir com o alvo de interesse, geralmente complexos com carga global positiva tendem a ser atraídos pela mítocõndria, pois esta possui potencial negativo em suas paredes celulares internas. Complexos com carga global negativa geralmente têm maior mobilidade dentro da célula (RAJENDRAN; YAPICI; MILLER, 2014).

[10 ] Dentre os iigantes mais utilizados em complexos de lantanideos para este tipo de aplicação encontram-se: derivados do DOTA (1, STRAUCH et al., 201.D, derivados de terpirictinas (2, MX2UKAHI et ai., 2011), criptatos (3, BOURDOLLE et al., 2011) e hel.icatos (4, CBAUVIN et al., 2008), cujas fórmulas moleculares encontram-se abaixo.

[11] Para a síntese dos iigantes utiliza-se o ácido dipicoliníco ou qiielidãnrdco coino molécula, de partida. No esquema abaixo são vistas as moléculas obtidas partindo-se do ácido dipico.linico (R = H) ou do ácido quelidârráco (R = OH) .

Este reagente de partida é muito utilizado devido 5

à sua versatilidade e poseibilidade de modificação, utilizando rotas orgânicas, tanto na cadeia lateral do ácido carboxiiico quanto na posição para do anel piridinico (ANDRES; CHAUVIN, 2011/ D'ALêO et al., 2008; ANDRES; CHAUVIN, 2013; DEITERS et al., 2009; ANDRES; · CHAUVIN, 2010; BET ENCOORT-DIAS et al . , 2010; CHAMAS et al., 2010) .

(13)No caso de modificações somente na posição para do anel piridinico a coordenação ao lantanideoílll) pode se dar de modo tridentado envolvendo o nitrogénio do anel piridinico e os dois grupos carboxilatos de modo monodentado. BRAYSHAW et al., 1995 utilizaram a difração de raios X do monocristal para mostrar este tipo de coordenação onde se destaca a importância do contra íon que interage coro os átomos de oxigénio nâo ligados ao lantanidoo de modo a formar uma estrutura pólimérica, como no caso do complexo Csal.£u (dipic)^) .

f l^JUt l x ndor-s© condições adequadas de sintese força- se a coordenação doe grupes carboxilato de outras maneiras formando polimeros de coordenação onde ha mais de m tipo de modo de coordenação dos grupos carboxilatos <HOU et al., 2011). Via de regra a modificação na posição pata do ácido quelidâmico nôo influencia de maneira drástica o poliedro de coordenação e normalmente a simetria pontual do íoc» európiodll) é próxima de um grupo D3h em complexos contendo iigantes derivados do ácido dipicolínieo ou quelidâmico. A coordenação tridentada deste tipo de ligante também é importante para a sintese de complexos com potenciais aplicações como marcadores luminescentea por apresentar estequíometria 3:1 <L:Ln>, o q¾e confer número de coordenação igual a e impede a coordenação de moléculas do rCTBR2*15/mil8

*

solvente, além de conferir boa estabilidade termodinâmica e boa solubilidade em sistemas biológicos. Desde o trabalho pioneiro publicado por LAKOWICZ et ai., 2001 onde foi mostrado que os ions lantanideos poderiam ser excitados através do processo de excitação multifóton e PIS2C2EK et al., 2001 onde foi mostrado que cromóforos orgânicos podem intensificar a absorção por multifótons, muito se tem explorado em busca de novos ligantes capazes de aumentar a secção de absorção por dois ou três fótons nos complexos contendo európio(HX) ou térbio(III). Muitos trabalhos reportaram a possibilidade de estender a conjugação do anel piridinico para deslocar a banda de excitação dos complexos para comprimentos d onda que possam ser eficientemente excitados pelos lasers utilizados em microscópios para o bioimageamento bem co o a possibilidade de excitação por dóis fótons (TPA) . A excitação por dóie fótons se mostra uma opção interessante, pois o material biológico tem baixa absorção próximo de 800 nm. D'ALÊO et ai., 2008; PICOT et ai., 2008; D'ALêO et al., 2007; MAURY et ai., 2013; ELISEEVA et al., 2010 mostraram que a extensão da conjugação do anel piridinico torna possível a excitação eficiente por dois fótons de complexos contendo európio(HI) ou térbio(III). O planejamento de ligantee capazes de ter bandas de excitação próximo do visível ou excitação por multifótons segue, basicamente, duas linhas: (i) cromóforo conectado à unidade coordenante, porém sem conjugação eletrónica <vide abaixo em (a)) ou (ii) cromóforo conectado à unidade coordenante com conjugação eletrónica (vide abaixo em ih)). 7

[15}Moléculas que apresentam absorção de energia em altos comprimentos de onda geralmente . ossuem estrutura eletrônica altamente conjugada e estados de transferência de carga com baixa energia. A estabilização do estado de transferência de carga é induzida, além da alta conjugação, pelo que se chama de estrutura push-pull, ou seja, presença de grupos elétron doadores e elétron receptores na estrutura da molécula. Neste caso, a coordenação do lantanideo diretamente na antena estabiliza ainda mais os estados de transferência de carga pois o lantanideo aumenta o efeito push-pull . WERTS et ai. 1999 observou que a coordenação da cetona de Michler ao complexo [Eu{fod)j$] promovia o deslocamento batocrômíco para a regiáo do visível da banda de absorção, a qual possuía caréter solva oc õmico, o que é uma característica dos estados de transferência de carga. Entretanto, no trabalho os autores nào conseguiram excluir a transferência de energia via tripleto mas sugeriram que poderia haver um outro tipo de mecanismo de transferência de energia. Exemplos mais recentes mostram que o nível tripleto pode não estar envolvido na transferência de energia mas é difícil excluir este mecanismo totalmente {A DRES; CHAUVIN, 2013) .

Além da aplicaç o como marcador lumínescente alguns 8

complexos de ions lantanídeos(III) podem apresentar atividade citotóxica contra células neopiásicas. REJI; PEARL; ROSY, 2013 reportaram complexos contendo európío (XIX) ou neodímio (211) com o ligante ácido feniltioacetato (Tabela lErro? Font» d* referência n*o encontrada») capaz de clivar o DNA e exibir atividade citotóxica contra células causadoras de câncer cervical (HeLa) e cólon {HCT116} em humanos. Os complexos se mostraram mais citotóxicos que o ligante isolado, o que mostra que os iantanideos têm papel essencial na atividade citotóxica com valores de IC50 iguais a 47,9 p olir* e 45,5 umoiL-l no caso do complexo contendo európio(III) para células HeLa e HCT116, respectivamente, e 43,8 pmolL-l e 28,3 umolL~l no caso do complexo contendo neodimio (III) para células HeLa e HCT116, respectivamente . Os valores de IC5Ô ainda são relativamente altos se comparados a fármacos comerciais utilizados para o tratamento de câncer cervical cujos valores sáo 1,5 ~ 3,0 pmolL-l (estramustina) , 22 μτηοΐ L"¹ (noscapina) e δ ^olL-^ (cisplatina) ou câncer de cólon com ICSÕ igual a 29,6 u olL" * (etoposida) . CHEN et al., 2011 reportaram atividade citotóxica de complexos contendo íons lantanídeos contra células causadoras de câncer no figado (BEL"? 04) cuja taxa de inibição determinada foi de aproximadamente 50 % e IC50 aproximado de 10 umol L~^∑, valor este bem inferior a fármacos convencionais como a cisplatina, cujo valor de 1C50 é de aproximadamente 35 umol Ir¹. LI et ai., 2012 reportaram atividade magnética e citotóxica de alguns complexos aniônicos contendo disprósío{III) e cátions derivados de fósforo (Tabela llraro! Font» d* eferência nâo encontrada.⁾ contra alguns tipos de células causadoras de câncer 9 pancreática. Apesar do efeito citotóxico contra células cancerígenas, aparentemente os complexos sSo cxtotoKtcos também para células sadias, nâo sendo portanto específicos. O?TOVA STEFfiNCVA, 2010a, 2010b teportaram atlvi ade citotóxiea de complexos contendo lantanídeos contra células causad as de melanoma (816) e fibrosarcotta (I>929) em ratos. Os complexos a resen aram IC50 aproximado de 49, S; 57,5; 15,1; 21,9 yrsolL~l para os complexos contendo euròpío (111) , praseodlmío (III) , lantânio (IIX) ou di sprósic {ΙϊΧ> , respectivamente, contra células do tipo BI 6 e IC50 aproximado de 35,3; 61,2; 13,9; 21,4 moll-1 para os complexos contendo eu ópio (2XX) , praseodímioOI!) , lantânio <I1I) ou disprósio (ϊΙΓ) , respectivamente, contra células do tipo L9 9. Para todos os casos os complexos tiveram que ser dissol idos &n uma eque quar.tidade do diié ilsulfÔKld (0MSO) por náo r se a am solubilidade eis sistem uoso e todos os testes for m feitos Lú vi tro, As estruturas dos

10

[17)0 estado da técnica antecipa amplamente a tilização de lantanideos, Os documentos US 20090281290 descreve complexos de lantanideo contendo iigan es do tipo pybox. W0 2011111607 descreve complexos de lantanideos com emissão polarizada, © WO 2011057126 antecipa macrociclioos sem centro metálic para o imageamento.

Desde US2003138876 é conhecido o uso pa a detecção do ácido dipicoiinico que ó um subproduto da atividade bacteriana, além do uso da espectroscopia de luminescência tanto para detecção quanto para quantificação dos esporos bacterianos.

(19] WO2006 3090 antecipa que compostos de lantanideos que apresentam atividade inibitória da RAF e B-RAF podem ser utilizados no tratamento de diferentes tipos de câncer, tais como câncer coloretal e melanoma. Já o WO200808493 descreve lantanldeos com atividade inibitória contra super produção de histamina e doenças autoimunes, bem como atividade antiproliferativa contra diversos tipos de câncer, tais como câncer das células pequenas do pulmão, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocitica aguda, síndrome ieiodiplástica, carcinoma coloretal e gástrico, glioblastoma e outros.

t20} Embora úteis, os documentos do estado da técnica não antecipam compostos derivados do ácido dipicolinico e/ou pybox modificado, com atividade no diagnóstico por imagem e/ou tratamento do câncer de tecidos moles.

OBJETIVO DA IKVENÇÃO

21IO primeiro cbjetivo da presente invenção é propor os complexos lantanideo-ligantes {Ln-D , que apresentam um baixo efeito citotóxico à células sadias, solúveis em água e úteis no diagnóstico e/ou tratamento do câncer de tecidos 11

atoles.

122} Outro objetivo da invenção é propor um processo de obtenção dos complexos lantanideo-ligantes (Ln-L) «

[23jô terceiro objetivo da invenção é propor o uso dos complexos lantanideo-ligantes (Ln-L) para o diagnóstico do câncer de tecidos moles.

[24)0 quarto objetivo da invenção é propor o uso dos complexos lantanideo-ligantes (Ln-L) para o tratamento do câncer de tecidos moles.

(25] Finalmente, é ainda um objetivo da presente Invenção propor ligantes derivados do ácido dipicolinico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[26} Para se obter uma completa visualização dos ob etivos da presente invenção, é necessária a leitura deste documento e a análise dos desenhos que o acompanham e aos quais se faz referências conforme segue abaixo.

Figura 1 - Espectros vibracionais na região do inf avermelho da série contendo o ligante Ia; (a) la na forma protonada (h) « sal de sódio do ligante Ia; (c)^« C»3ÍEu{∑a)3j; íd) ~ K3fEu(la}3] <e) ** Cs₃[Sd{la)₃) (f) * Cs₃[Tb(Ia>3}; (g) - Kj [Tb (Ia)₃] .

Figura 2 - Espectros vibracionais na regiáo do inf avermelho da série contendo, o ligante Ib. <a}^« Ib na forma protonada; <b) ∞ sal de sódio do ligante 1b; (c) ~ Cs₃[Eu(Ib)₃] ; (d) - K₃[Eu{Ib)₃]; Ce)^» Cs₃(Gd )₅] {£} ~ Cs3ÍTb(lb)₃] ; (g) ~ K₃ [Tb (Ib) 3] .

Figura 3 - Espectros vibracionais na região do infravermelho da série contendo o ligante II: (a) ∞ II; (b)

CEu⁽IX) 3} (CF₃S0₃) 3 (C)^« [Gd(II)₃] {CF₃S0₃)_¾; (d) ÍTb{II}₃] <CF₃S0₃)₃. 12

130] Figura 4 ~ células NGS? de giioblastoma utilizando meio celular contendo o complexo K3[Eu{L lb)i] como marcador Xuminescente em diferentes tempos de incubação da célula ao complexo, (a) Ausência do complexo, (b) 3 h, (c) 6 h. (d) 12 h. (e) 24 h.

f31]Figt$ra 5 - Viabilidade celular de células NIR/3T3 após incubação aos ligantes e seus respectivos complexos, determinada por MTT; (a) 24 h de incubação; íb) 48 de incubação.

[323 Figura 6 ~ Viabilidade celular de células NX8/3T3 após incubação aos ligantes e seus respectivos complexos, determinada por VN; (a) 24 h de incubação; (b) 48 h de incubação.

Figura 7 - iabilidade celular de células NG97 após incubação aos ligantes e seus respectivos complexos, determinada por MTT; (a) 24 h de incubação; b) 48 h de incubação.

£343 Flyur<¾ 8 ~ Viabilidade celular de células NG$7 após incubação aos ligantes e seus respectivos complexos, determinada por VN; (a) 24 h de incubação; (b) 43 h de incubação .

igura 9 - Viabilidade celular de células PANC-l após incubação aos ligantes e seus respectivos complexos, determinada por MTT; <a) 24 h d« incubação; (b) 48 h de incubação.

1361 Figura 10 - Viabilidade celular de células PANC1 após incubação aos ligantes e seus respectivos complexos, determinada por VN; (a) 2 h de incubação; (b) 48 h de incubação.

Figura 11 ~ fotainicrografias do ensaio de 13

transposição da barreira hematoencefálica; (a) ausência do complexo sCEuíL Ib)₃J; (b) presença do complexo K₃[E (L Xb)3l utilizando montagem mostrada em (a) (c) presença do complexo 3ÍEu<L lb i] utilizando montagem mostrada em (b) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA IUVENÇAO

Sintmsm do lifmntm Dlpic&s

[38JO ligante Ia {DipicNs} è derivado do acido dipícolinico de Fórmula Ia, onde R é 83.

[ 39J Inicialmente na etapa (a) , o ácido quelidâmico monohidratado (i) é extraído em uma solução de extração contendo um sal e Um catalisador, sob agitação e temperatur variável entre 70*C e 90 *C, preferencialmente 80*C, durante um período entre 20 e 3Q . O excesso de sal é removido da reaçáo u ilizando alto vácuo e sistema trap-isy-t ap com nitrogéni liquido, sendo obtido o composto intermediário íii) que é sólido.

(403 Preferencialmente, o sal cia solução de extração ê o cloreto de tionila (SOCI2} em um voiume variável entre S e 15 mL, preferencialmente 10 mL. O catalisador é a dimetilformamida (DMF) em um volume variável entre 20 e 100 Χ,, preferencialmente 40 \iL.

{ 1 J Como pode ser observado na Equação (1), o composto intermediário (ii) obtido conforme acima, é utilizado para a produção de ambos os compostos intermediários (iii) e (iv) . 14

Equação 1

Para a produção dos ligantes Ia, uma primeira fraçào do composto intermediário (ii) é reagida com uni volume variável entre 10 e 30 mL de um álcool C.1-C3, ref renc almente 20 mL, sob agitação vigorosa sendo formado um precipitado sólido, que é mantido sob agitação vigorosa durante entre 30 a 90 minutos à temperatura entre 20 e 25*C. Em seguida o álcool C1-C3 é removido sob pressão reduzida e o precipitado solido ê dissolvido com um solvente orgânico. Em seguida a fase orgânica é lavada com água e solução saturada de cloreto de sódio {2x) » As fases orgânicas são combinadas, secas com um sal de sódio, tal como o NajSO«, filtradas e o solvente removido sob ressão reduzida para obtenção do composto (iii) .

Preferencialmente, nesta etapa, o álcool C1-C3 é o metanol .

44] Entre 10 e 15 mmol do composto intermediário <iii} é dissolvido com uma solução contendo entre 100 e 150 mmol de KaN3 e DMF em um volume variável entre 10 e 30 mL, preferencialmente 15 mL, durante entre 20 e 30 h, preferencialmente 24h, sob agitação e aquecimento variável entre 60*C e 80"C, preferencialmente 7Q*C. Em seguida, a suspensão é refrigerada até atingir a temperatura entre 20*C 15

e 25*C. Um volume de água variável entre 100 e 1000 ml>, preferencialmente 400 mL, é adicionado ao sistema e a suspensão é mantida sob agitação vigorosa até a precipitação do composto intermediário (v) , que é removido da solução por filtração e levado com água gelada.

Em seguida, uma fração contendo entre 6 e 10 iranol do composto intermediário (v) é ressuapensa em un¾t solução contendo E»íF em um volume variável entre 10 e 30 L, preferencialmente 15 mL e entre 50 e 500 mg, preferencialmente 250 mg, de Pd/C (10% massa de Pd) sob agitação, a temperatura entre 20 e 25^eC, durante entre 20 e 36 h, sob fluxo de hidrogénio obtendo-se assim uma solução contendo o composto intermediário (vi) (Equação 2) .

1

Equação 2

H6]0 ligante Ia é obtido pela diluição de entre 0,2 g e 1,5 g, preferencialmente 1 g, do composto intermediário (vi) é diluído em solução aquosa contendo aOti cuja concentração esteja entre 0,5 e 3 mol lr^l, preferencialmente 2 mol L^_i, sob refluxo e agitação entre 6 e 15 . Em seguida, é adicionada uma solução aquosa ácida de pH entre 1,5 e 2,5 16

para sua precipitação- Líqant Di i N}

(47] A invenção trata ainda dos ligantes derivados do ácido dipicolinico que apresentam a Fórmul I (Ia} :

seus sais e solvatoa; em que: é Nj.

{ 8J Preferencialmente, o ligante derivado do ácido dipicolinico de Fórmula Ia é o 4- azidopiridína- 2, 6~ dicarboxilato, seus sais e aolvatos.

O ligante de Fórmula Ia é útil na produção dos complexos lantanídeo-ligantes Ln-L.

Sínt ae do MLganm PyboxSHj

150} Para a produção do ligante II (PyboxNHjt) , inicialmente, uma segunda fração do composto intermediário (ii) è dissolvida com um solvente orgânico e transferida a um funil de adição. Em seguida o composto diluído é lentamente adicionado, em uma temperatura entre 0 e 2^eC, à solução contendo uma entre 10 e 15 mmol de cloroetilamina protonada e entre 20,0 e 25,0 mmol de uma base forte em banho de gelo. Após completa adição, a temperatura da reaçào é elevada à temperatura entre 20 e 25*C, e a solução é agitada durante entre 90 e- 180 minutos; em seguida o solvente orgânico é novamente adicionado.

Em seguida a fase orgânica é lavada com água e uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio . Após a lavagem as f ses orgânicas a&o secas com um sal de sódio, tal coroo o HajSOv, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida para obtenção do composto intermediário { iv) >

[52 )A Equação (3) indica as reacóes que levam à obtenção do ligante de Fórmula (∑l) . 17

Equação 3

Í53JA Equação 3 ocorre quando entre 3 e 6 mol do composto intermediário (iv) é dissolvido em solvente orgânico e transferido a ura funil de adição e a essa solução é adicionada lentamente a uma solução contendo NaH e THF a uma temperatura de 0*C. Em seguida, a temperatura é elevada até 25^eC, e mantida sob agitação durante entre 20 e 36 horas. Após esse período, é adicionada água para remoção do excesso de NaH, e a fase orgânica é extraida com um solvente orgânico. Em seguida a fase orgânica é lavada com uma 3oluçào aquosa de cloreto de sódio e secada com um sal de sódio, tal como o Na2S0 , filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida para obtenção do composto intermediário <vii) .

Entre 6,5 e 9 mraol do composto intermediário (vil) é dissolvido em um solvente orgânico, com subsequente adição de entre 70 e 85 mmol de NaNa. A suspensão assim obtida é mantida sob agitação a uma temperatura de entre 60 e 80 *C durante 20 a 36 h. Ao final da reaçâo, o solvente é removido sob pressão reduzida e o composto intermediário (viii) é extraído com a adição de CH2CI2. 0 produto obtido é lavado com u a solução aquosa de cloreto de sódio e seco com um sal de sódio, tal como o NazSQ«, filtrado e o solvente é removido sob pressão reduzida.

£55] Para a obtenção do ligante II, entre 4 e ? mmol do composto intermediário {viii) é dissolvido em um solvente 18

orgânico e uma solução entre 4,5 e 7 iramol de NaBH< diluído no mesmo solvente usado para dissolver o intermediário (vil) . Essa solução é mantida sob agitação e refluxo durante entre 20 e 36 h. Em seguida o ligante II formado è filtrado e lavado com solvente puro e diluído em água para ex ração.

156] O solvente orgânico usado neste processo é pertencente ao grupo conaistido de clorofórmio, dimetilformamida (DHP) e tetrahidrofurano <THF} , Nas etapas acima listadas, um único solvente ou todos os solventes podem ser usados independentemente, de acordo com a etapa.

57] esta forma, na etapa {a) são produzidos os lígantes de fórmula X e XI, onde preferencialmente R é Nj ou NHí. Mais preferencialmente os lígantes de Fórmula I e II são o 4- azidopiridina-2, 6-dicarboxilato, 4-aminopiridlna~2, 6~ dícarboxilato, e 2, 6-bis<4, 5-didroxoxazol-2-il)piridina~4~ atnina.

(58}Ainda mais preferencialmente, os ligantes de Fórmula I e II são o 4~azidopirídina-2, 6-dicarboxíiato, 4- aminopiridina-2, 6-*dicarboxilato, e 2, 2"- (4-aminopiridina- 2, 6dii)bis (4, 5-dihidrooxazolina) .

X . mnt* PyboxXH2

(59) A invenção trata ainda dos iigantes derivados do ácido dipícolínico que apresentam a Fórmula II:

II seus saís e soivatos, em que: è NHz,

[60J Preferencialmente, o ligante derivado do ácido dipicolínico de Fórmula II é o 2, 6~bis(4,5-didroxoxazol-2- 19

il)piridina~4~amina, seus sais e solvatos.

0 ligan e de Fórmula II é útil na produção dos complexos lantanídeo-ligantes Ln~L.

Complexo P-tjaicW?

(62] A presente invenção se refere ao complexo lantanideo-iigant (Ln-L) , onde:

Ln é Eu'% <3d^3> o Tb⁵*; ,e, L é ura ligante de Fórmula I

I seus sais e solvatos, em que: R é N -

(63) O complexo Ln-L é Ln-4~azidopiridina~2, 6- dica boxilato, seus sais e solvatos.

(64 ] Os complexos Ln-L, seus sais e solvatos, s§o solúveis em água e luminescentes . Teste realizados com células PANO 1 e NG97 indicam que os Ln~L da presente invenção sáo úteis no diagnóstico e tratamento do câncer de tecidos moles, tais como o câncer de pâncreas, o glioblastoma multiforme, as roeitom s, oligodendrogliornas, e oligoastrocitomas, e sâo poucos tóxicos ás células nâo carcínogênicas «

[65] A presente invenção se refere ao complexo lantanídeo-ligante (Ln-L), onde: Ln é lantanideo, preferencialmente £u³⁺, Gd³⁺ ou Tb⁵⁺ e L é um ligante de 20

Fórmula II

seus Sais e solvatos, em que R é H;.

{66] O complexo Ln-L é o 2 , 2 ' ~ (4~aminopiridina~2, 6diil) - bis (4, 5~dihidrooxazolina) .

Proc0*so dm obtenção do omplmxo DipicH3

O processo de produção de complexo la tanldeo- lígante {Ln-L} compreende as etapas de:

(a) Síntese doa ligantea (L) e,

E

I seus saís e solvatos, e que: R é N3.

(b) Síntese dos complexos.

681 Na etapa (b) a uma solução aquosa em pH entre 5 e 7, preferencialmente 6, contendo entre 1 e 5 mmol do Xigante la é adicionada entre 0, 1 e 1 mmol de um óxido de lantanideo de fórmula geral LnsOs, sendo mantida sob agitação, a uma temperatura entre 90 e 110'C entre 30 e 90 minutos. Ao final deste tempo, são obtidos oa complexos Ln-L Ia, dependendo da solução de partida.

Preferencialmente, nesta etapa no óxido de lantanideo, Ln é lantanideo, eferen ialmen e Ru³*, Gd³⁺ ou ?b³⁺. 21

Prpc MO d* obtenção do cxmplmxo Pji pxifâi

Alternativamente, na etapa (to), para a obtenção do complexo Ln-L II entre 0,5 e 2 mmol de triflato de lantanídeo de fórmula L {CF3$03)j é adicionada a uma solução ltl de solventes orgânicos contendo entre 1 e 5 mmol do ligante II, sendo mantido sob agitaçSc a uma temperatura entre 40 e 70^*C, entre 2 e 6 n. Preferencialmente, a solução 1:1 de solventes orgânicos é uma solução contendo um álcool C1-C3 e diclorometanc, e o lantanídeo é preferencialmente £u³*, Gd³⁺ ou Tbⁱ⁺.

Mais preferencialmente, o álcool é o metanol e Ln é Eu³⁺ ou Tb3+.

t?2]Qs complexos Ln-L Ia, Ln-L Xb e Ln-L II e seus sais e solvatos são solúveis em água, e úteis no diagnóstico e tratamento do câncer de tecidos moles, tais coroo o câncer de pâncreas, o gliofolastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, e oligoas roeitomas.

[73|Ê ainda um objeto da presente invenção o uso dos complexos Ln~L, seus sais e solvatos, no diagnóstico por imagem do câncer de tecidos moles pertencentes ao grupo compreendido de: câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, e oligoastrocitomas .

(743 Outro objeto da presente invenção se refere ao uso dos complexos Ln-L, seus sais e solvatos, para a produção de um medicamento voltado para o tratamento do câncer de tecidos moles pertencentes ao grupo compreendido de: câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, e oligoastroeitomas .

{75)0 uso dos complexos Ln-L no diagnóstico e tratamento 22

do câncer de tecidos moles se dá pois os complexos Ln-L da inv nção apresenta» um elevado valor de IC50 para células sadias e baixo valor de ZCSO para células neopláaicas, conforme pode ser observado na tabe a 2 abaixo:

^ ·/ ^o 2C50 m

«IH/3T3 PAtfCl SIH/3T3 PANCi

I.· la > 561 > 200

RjiLa(L Ia)}] > 229 > 200

alEuti» r<*) j] 225 172 217 > 2.00 193

Kj b{L Ia}»] > 224 116 > 224 > 200 104 > 200

L Ib > n ao > 200

KjfLaíL ∑ )i] > 251 > 200 jCEu raui > 247 111 235 200^■iSÔ j! fe (I_* Ib) i] > 245 > 200

t II > 861 > 200

(La{L II í <CFJSÓ$)J

[Eu (L II) j] <CF,SOj) j 154 > 200

(Gdíi, XI H] <CF_}S0>)j

[ b l II)₃) (CFJSOJ) j > 154 75 154 200 103 > 200

TiiWfilo»

Exem lo 1 Sinte.se do composto intermediário (1)

{dimetll-4-cloropiriditt¾-2, 6-dicarboxi atofr :

í 763 O ccanposto intermediário ii) foi. preparado de acordo com procedimento adaptado de IGLESIAS et al., 2000. 3,0 ç U6,4 romol) de ácido guelidâmico monohidratado foi suspenso em 10 mh de cloreto de tionila (SOCI2) contendo uma gota de DMF como catalisador. A suspensão foi agitada por 24 h sob refluxo» formando «ma solução verde clara. A remoção do excesso de cloreto de tionila foi feita utilizando alto vácuo e sistema txap-by~trap com nitrogénio liquido. O sólido branco correspondente ao cloreto de ácido formado nâo foi isolado, e a este foi adicionado 12 mL de metanol sob agitação vigorosa. Imediatamente houve a formação de um precipitado branco o qual foi mantido em agitação vigorosa a temperatura ambiente por 1 h. Após l h o solvente foi removido sob pressão reduzida e o sólido branco dissolvido 23

em clorofórmio. A fase orgânica foi lavada com água <2x) e solução saturada de cloreto de sódio (2x) . As fases orgânicas são combinadas, sec s com if&2SOt, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida para obtenção de um sólido branco. {Rendimento: 3,08 g; 82%).

Exemplo 2 ~ Síntese d compost intermediário Çv? {dimetil 4-azidopiridina-2/ 6-di arboxila o) ;

O composto intermediário (v) foi sintetizado de acordo com procedimento adaptado de HUAHC et al., 20Q3 CHAMAS et al . , 2010). 3,0 g (13,1 mmol de (i) foi dissolvido em DMF e 8,494 g {131 mmol) de Na ^ foi suspenso formando um suspensão de cor amarela. A suspensão foi mantida em agitação e aquecimento por 24 . Após este intervalo de tempo a suspensão foi resfriada até atingir temperatura ambiente e vertida em água e gelo. A agitação vigorosa foi mantida por alguns minutos até precipitação completa de um sólido branco que foi filtrado e lavado com várias porções de água gelada. (Rendimento: l,81g í>7$) .

Exemplo 3 - Síntese do composto intermediário vi) (dimetil- 4-aminopiridina~2, 6-dicarboxilato) :

(7830 composto (vi) foi sintetizado de acordo com procedimento adaptado da literatura ÍHDANG et al., 2003). 2,0 g (8,5 mmol) de (v) e 300 mg de Pd/C (10%) foram suspensos em DMF. h suspensão de cor preta foi agitada a temperatura ambiente e sob fluxo de hidrogénio por 24 h. O éster intermediário pode ou nâo ser isolado. O isolamento do éster é dificii, pois necessita-se passar a suspensão através de filtro contendo Celite. Como o solvente da reação é DMF a maior parte do produto fica retido no filtro de Celite. Desta forma não é recomendável que se isole o intermediário o que 24

não causa problemas para a próxima etapa uma vez que a conversão da azida em amíno é total (verificado por TLC e ^H-RMN) . Porém foi isolado uma pequena parte deste intermediário para efeitos de caracterização.

Exemplo 4 - Sintese dos 1iqantes la <4-a2idopiridina-

2, 6-dicarboxilato) e_ι Ib (4~aminopirldina~2, 6- dicarboxi ato) ;

[79| Os liçantes la e Ib foram preparados da mesma maneira: 1,3 g dos respectivos ésteres (v ou vi) foram suspensos em solução aquosa contendo 8 mL de NaOH 2,5 mol L^* *. A suspensão foi agitada sob refluxo por 12 h. Ao final das 12 h verifica~se a completa solubilizaçâo do sólido, fato este que indica a hidrólise do éster gerando o sai de sódio do respectivo carbo.xi.la ©.. O ácido foi precipitado pela adição de solução aquosa 10 % de HC1 até pH -2. 0 sólido branco f r ado foi fil ado e lavado com água gelada. (Rendimento^; 0,8 g; 71%),

Exemplo 5 - Síntese do composto intermediário v) (4~ cloro~N², K⁶-bis (2-cloroetil) irldlna-2, 6-dicarboxamida) :

18Õ) O composto iv foi sintetizado de acordo com procedimento descrito por de BETTENCOURT-DIAS, VISWANATHAN, ROLLET, 2007; NISHIYAMA, 1989. A primeira etapa que consiste na conversão de ácido cartaoxilico a cloreto de ácido jâ foi descrito para a molécula i . Após a remoção do excesso de cloreto de tíonila o sólido branco foi dissolvido em clorofórmio e transferido a um funil de adição. A solução ciorofórmica foi adicionada gota a gota a 0 °C a uma suspensão de 1,496 g (13,2 mmrool) de 2-cloroetilamina protonada e 1,37 g (24,4 mol) de KOH suspensos na menor quantidade de água possível. Após a completa adição o banho 25

de gelo foi retirado e a suspensão agitada à temperatura ambiente por 2 h. A suspensão foi diluída em clorofórmio lavada com água (2x) e solução aquosa de bicarbonato de sódio <2x) . As fases orgânicas são combinadas, secas com Na2SO<, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida. {Rendimento: 1,59 g; 76%).

Exemplo 6 - Síntese do composto intermediário ( ii > (2, 2* - <4-cloropiridina-2, diil)bis (4, 5-dihidroxazolina) :

[81JO composto {vii) foi sintetizado de acordo com procedimento descrito por de BETTENCOURT-DIAS, VISWANATHAN, ROLLET, 2007; HISHIYAMA, 1989. 1,5 g <4,6 mmol} do composto (iv) foi dissolvido em 10 L de TH e transferido a um funil de adição, A solução foi adicionada gota a gota a uma suspensão de 1,05 g de NaH em THF a 0 °C. Após a completa adição o banho de gelo foi removido e a suspensão agitada a temperatura ambiente por 24 h. Ao fim das 24 h o excesso de NaH foi eliminado pela adição de água. A fase orgânica foi extraída com clorofórmio (3x) . As fases orgânicas sâo combinadas, lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (2x) , secas com Nã?SOi, ilt ada e o solvente removido sob pressão reduzida. (Rendimento: 1,05 g; 90%) y Ewwxwfei.i i.i im.i i.i i.i >*p| j >l—o———7i M -I i Siínte■s■e -■ I ido ic Mom■pIToi sto interrmffi fefffdffffirá rrrrio r (v ri πí rírr Τ)Ι

2,2' - (4~azldopiridina-2, 6diii) bis_f 5-dihidroxazolina) ;

182} O composto {viíi) foi sintetizado de acordo com procedimento descrito na literatura (HUA G et al., 2003), 2,0 g (7,9 mmoi}. do composto (vii) foram dissolvidos em 15 mL de DMP, a esta solução foi adicionado 5,122 g {79 ramol} de NaNj, formando uma suspensão de cor amarela. A suspensão foi mantida sob agitação e aquecimento a 70 "C por 24 h. Ao final das 24 h o solvente foi removido sob pressão reduzida 26 e o produto extraído com diclorome ano. A fase rgânica foi lavada com água (2x) , as fases combinadas/ secas com Na^SO^, filtradas e o solvente removido sob pressão reduzida. {Rendimento: 1,81 g; 88%)

Exemplo 8 - Síntese do ligaste II (2,2'~{4~ aminopiridin.a~2, 6 diipbis (4, 5-dihidroox¾2olina) .

|83]0 composto II foi sintetizado utilizando método adaptado de PRESTON, GALLUCCI, PARQUETTE, 200S. 1/5 g {5,8 mmol) do composto (viii) foi dissolvido em THF, a esta solução foi suspenso 227 mg {6 mmol) $aBH₄. A suspensão de cor marrom foi mantida sob agitação e refluxo por 24 h. 0 precipitado formado foi filtrado lavado com THF e solução aquosa de THF (SO % v/v}. (Rendimento: 0,55 g 41%).

Exemplo 9 - Complexos lantanideo ligan es la e Ib:

(84] Os complexos foram sintetizados de acordo com procedimento . adaptado de BRAYSHAW et al J, 1995. 0,5 mmol de Lrt*03 <Ln^« La³*, Eu³*, Gd³⁺ ou b³ ) foi adicionado a uma suspensão de água contendo 3 mmol de L (L « Ia ou Ib) . A suspensão foi mantida em agitação a 100^'°0 por 1 h, seguido do ajuste do pH com pequenas porções de ^COa (M ~⁺ ou Cs⁺) . A formação do complexo foi evidenciada pela. completa dissolução da suspensão formando uma solução transparente. A solução foi filtrada, o solvente evaporado e o sólido seco sob vácuo. Para a série de complexos contendo o ligante Ib monocristais aptos para difração de raios X foram obtidos através da difusão lenta de metanol em solução aquosa dos complexos.

Exemplo 10 - Complexos lantanideo ligante II :

Í85U mmol de L < CF3S0₂)₃ (Ln - La³*,. Eu³⁺, Gd^3* ou Tb^3*) foi adicionado a uma solução dicl rometa.no: etanol (1:1), em 27

volume, contendo 3 mcl de L (t, * Ib XX) . O sistema foi mantido em agitação e aquecimento de 50 °C por 4 h. A solução de coloração marrom escuro foi filtrada, o solvente evaporado e o sólido recolhido e armazenado em dessecador.

Exemplo 11 - caracterização dos complexos Ia, Ib e II:

[86} Os espectros vibracionais na região do in avermelho foram obtido» «a forma de pô em um espectrofotÔmetro FT-IR Bomen FTLA 2000, no intervalo espectral de 3500 a 550 cm'¹ com resolução de 2 crrr¹. Os deslocamentos químicos dos espectros de^JH~RMN foram obtidos em solução utilizando solventes deuterados em espectrômetro Varian 400 ou 500 MHz. Todos os espectros de massas foram obtidos em solução nos modos positivo ou negativo no equipamento Waters Micromass 2Q quadrupole.

(87] Os espectros de emissão e de excitação foram obtidos a 77 e 298 K, respectivamente, utilizando-se espectrofluorimetro Fluorolog-3 (Horifoa FL3-22LHR320) , com monocromador dupio a excitação {1200 gr/mm, 330 rw. laz¾) e duplo na emissão {1200 gr/mm, 500 nm blaz®} como fonte de excitação foi utilizada lâmpada continua de xenônio de 450 W de potência ozone free. O espectro de excitação foi obtido na faixa 250 - 500 nm e corrigido em tempo real de acordo com a intensidade da lâmpada e o sistema óptico do monocromador de excitação utilizando diodo de silício como referência. Os espectros de emissão foram obtidos na faixa 450 - 750 nm utilizando modo de detecção frant face (22,5 °) para sólidos ou right angle (90 °) para solução. Todos os espectros foram corrigidos de acordo com o sistema óptico do monocromador de emissão © a resposta da fotomultiplicadora (Hamamatsu R928P) . Os valores de rendimento quântico para os complexos de európio (ITT) e térbio(III) foram obtidos com as amostras em solução de concentração igual a 1»I(H mol L^*1 em relação aos padrões de európio (Cs¾ (Eu (la) 1] , Φ - 24%) ου têrbio (Cs₃[Tb(Ia)₃]. Φ - 22%). As excitações foram escolhidas de modo que o valor da absorção no comprimento de onda obedecesse a condição: A < 0,05. Os espectros de emissão ou excitação foram corrigidos em tempo real de acouio com a intensidade da lâmpada e o sistema óptico do monocromader de emissão (no caso dos espectros de emissão} ou excitação (no caso dos espectros de excitação) utilizando diodo de silício como referência- Os tempoa de vida do estado emissor δD₉ do európio(III) e δD₄ do térbio(lll) noa complexos foram obtidos pelas curvas de decaimento de emissão com excitação na banda do iigante com o fostarimetro Horiba Jobin γνοη, modelo FL- 1040 e lâmpada pulsada.

Os espectros de infravermelho foram obtidos ceia intenção de verificar a coordenação do metal pelos ligantes . fara todas as séries de complexos contendo o mesmo Iigante e diferentes ions lantanideos o perfil dos espectros obtidos é -similar. Na Figura 1 é apresentado o espectro de absorção na região do infravermelho parai σ Iigante Ia na forma protonada e desprotonada bem como os respectivos complexos contendo Eu₃⁺, Gd₃⁺ e Tb₃⁺. A atribuição dos principais modos vibraciortais esta mostrada na Tabela 1.

2Í44 e^•630 1335

2.103 -

2144 ô

C«*[Gd(Ia⁾j3 - 1640 1350

2103

2144 ê

Cs₎(T (Za)₁! - 162$ 1350

21C3

3144 «

2103 - 1647 13SC

(891 Na Figu a .? é apresentado o espectro de absorção na regiào do in ra ermelho para o iigante Ib na forma protonada e aosprotonada bem como os respec ivos complexos contendo

Eu₃⁺, Gd- e Tb**. A atribuição dos pr ineipai.s modos vibracionais eistá mostrada na Tabela 2 abaixo.

C n osto v(N-H> v(OOí v,_M(C O-> / v_e(C O-) v(C-05 / cim^*1 cmr^J cnr^» CBI'^! cm^*'

3555 e

ifo 3 7 no? - 1352 e

1334

— 1525 - 1334

1635 1334

3349 ** 1635 1354

csjíSuifc):.. 3349 - 16 5 1354

CsslTbdbJ 33 8 — 1S3S 1354

K₃sTfc{Ib) j] 3343 163S 1354 [90 ] anto > a série de complexos contendo os ligantes Ia ou Ib apresentam o mesmo comportamento frente à técnica de caracterização utilizando absorção vibracional na região do in ra ermelho. É amplamente conhecido na literatura que complexos contendo ligantes derivados do ácido dipicolxnico se ligam de forma monodentada com relação ao grupo carboxilato, também pode haver a. possibilidade de ir.teração do contra ion com o oxigénio nào ligado ao lantanideo conectando unidades vizinhas em uma espécie de "ponte". Os valores obtidos nas Tabelas 1 e 2 mostram que há coordenação peio grupo carbcxilato, é difícil fazer urna comparação dos valores de Δv com o sal do ligante devido a mistura de bandas do estiramento C=C e C=N anll piridinico e os estiramentos assimétrico e siroétri co do grupo carbcxilato.

f91|Ka Figura 3 é apresentado o espectro de absorção na região do infravermelho para o ligante 11 bem como os respectivos complexos contendo Eu₃⁺, Gd₃⁺ e Tb₃⁺. A atribuição dos principais modos vibracionais está mostrada na Tabela 3

{ 92 ] Nesto case o espectro de absorção vibracional na região do infravermelho não forneceu informações relevantes a respeito do modo de coordenação. Só foi possível constatar vibrações relativas ao grupo SO₃- devido à presença do grupo triflaco, o que é um forte indicativo da complexaçáo.

Exemplo 12 - Aplicação dos complexos como marcadores luminescentes :

(9310 complexo K₃[Eu(L Ib)₃] testado come marcador luroinescente de células NG97, pois apresentou melhor valor de rendimento quântico e também luminescência quando excitado em 405 nm. O outro motivo que levou à escolha do complexo de európio III) é que sua emissão se localiza na regíâo do vermelho, onde há baixa intensidade de emissão dc material biológico. As imagens de microscopia foram obtidas na ausência do complexo, além de utiiizando-se concentração do complexo igual a 200 μmolL^-1 e tempos de incubação da célula ao complexo iguais a 3, 6, 12 e 24 h respectivamente.

Na Figura 4 podem ser observadas células NG97 de glioblastoma crescidas em meio celular contendo o complexo K₃(Eu(L Ib)₃] como marcador luminescente em diferentes tempos de incubação da célula ao complexo, ia) Ausência do complexo, (b) 3 h. (c) 6 h. (d) 12 h. (e) 24 h. Ern todos os casos a primeira coluna refere-se á imagem somente das células, a segunda coluna à emissão do complexo e a terceira coluna à sobreposição das duas imagens.

Exemplo 12 - citotoxlcidade doa complexos frente a células sadias e neoplásicas:

Células PANC-1 (ATCC^© CRL-.1469™, carcinoma epítelioíde de dueto pancreático) ; NG97 (astrocitoma tipo III e IV) e NIH/3T3 (ATCC^© CRL-16S8™, fíbroblasto embrionário de Mus músculos) foram cultivadas em meio RFMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (BSA, Cultilab, BR) e 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicína, Cultiiab, BR) . As células foram piaqueaclas em garrafas de 75 cm² ou em placas de 60 cm², na densidade de 2 10'^; células mL-¹ e incubadas a 37 °C sob atmosfera com 5 % de CO;:.

(9é|A viabilidade celular é avaliada através da medida da capacidade das células de reduzir o MTT (3-brometo de (4, 5-dimetii-2-t.ía?olil) -2, 5-difenil-tetrazólio) a formazan. O formasan é um pigmento insolúvel que é extraído das cèiuias e quantificado espectrofotometricamente em λ - 570 nm. A redução do MTT é catalisada principalmente pelas desidrogenases mitocondriais e também do citoplasma. Portanto, a alteração da função raitocondriai poderá ser detectada através da variação da capacidade de redução do MTT.

As células foram plaqueadas na densidade de 10 10³ células mL^-l em placas de 36 poços e incubadas a 37°C, 5% de CO₂ por 24 h. 0 meio foi substituído pelos compostos testes diluídos em meio suplementado. Após 24 e 48 h de incubação, o meio de tratamento será removido, os poços serão lavados cem tampão salina tamponado com fosfato ÍBSA) e adicionado meio sem soro contendo o corante MTT (0,5 mg mL^-l) . Apôs incubação por 3 h a 37 °C, o meio será retirado cuidadosamente e adicionado 100 μL de etanol para sclubiiizaçâo do forrnazan. As placas seráo agitadas por 20 minutos e a absorbância correspondente a cada poço será lida no leitor de placas em λ = 570 nm. Os valores serão expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao controle, onde as células nao serão expostas aos agentes testes.

Exemplo 13 - viabilidade Celular Através da Incorporação do Vermelho Neutro:

A viabilidade celular é avaliada através da medida da capacidade das células de captar o vermelho neutro (VN: hidcocloreto de amino-m-diroet.iiawino~2-metil~fenazina) . As células são fixadas e o VN intracelular é extraído e quantificado espectrofotometricamente em λ = 540 nm. A captação do VN é realizada pelos lisossomos e então, este teste reflete a integridade da membrana cios lisossomos e consequentemente, um indicativo da viabilidade celular.

Após a exposição as diferentes concentrações dos compostos, as células serão lavadas com PBS e serão adicionados 100 μL de meio sem soro contendo 50 μmol mL^-l do corante vermelho neutro. Após 3 h de incubação em estufa umida a 37 °C Oontende 5% de CO₂, as células serão lavadas com solução de fixação de formol/cálcio (formol 4% acrescido de CaCl2 1%) por 2 min e o corante captado pelos lisossomos será extraído cota solução de extraçac de ácido acético 1%/etanol 50%. As placas serão agitadas por 10 min e a absorbáncia cotrespondente st cada poço será lida no leitor de placas em λ - 540 nm. A viabilidade celular será expressa em porcentagem em relação ao controle.

A grande vantagem dos complexos Ln-L da presente invenção é sua solubilidade em sistemas aquosos e capacidade de funcionar como marcador luminescente. Porém para que um marcador seja utilizado este nào deve possuir atividade citotóxica. Os complexos K3[Ln (LIa)₃ ] , K₃(Ln(L Ib)₃] e [Ln(L II)₃] (CF_aSO₃)₃ bem como os ligantes L Ia, L Ib e L II tiveram sua citotoxicidade testada contra células sadias (N2H/3T3 - Figura 5 e 6) , e células neo-plâsicas (SG91 - Figura 7 e 8 - e PANC1 ... Figura 9 e 10).

liGllEm face dos resultados obtidos fica claro que o iigante por si só não apresenta nenhum tipo de atividade citotóxica em relação a células normais (NIH/3T3) ou neoplasicas e PANC1) . Sendo de suma importância a presença do lantanídeo para que o composto apresente algum tipo de atividade citotóxica. Atividade esta que é altamente especifica contra células NG97 e PANC1 sendo que células normais são minimamente afretadas (Figuras 5 - 10) . Este resultado confirma a suspeita iniciai levantada nas imagens da marcação luminescente pelo complexo K:<IEu(L ibJs) de células do tipo KG97. É Enteressante observar que os complexos K₃(Ln (LIa) 2] e [Ln <LII) 3] (CF₃SO₃)₃ apresentaram atividade relatixramenté maior que os complexos K₃[Ln(L Ib) a] . Seria esperado que ambos os ligantes LIb e LII apresentassem atividade semelhante uma vez que ambos contém grupo amína na posição pata do anel pirid.inicc. Hâ, porém, uma única diferença entre estes dois complexos no que se refere a carga do ion complexo. O complexo que apresenta maior atividade, o qual contém o ligante L II em sua esfera de coordenação, apresenta carga do ion complexo positiva, Sabe-se que a carga é um fator: importante no meio celular o que pode indicar que a carga global positiva interaja com alguma porção ou organela especifica da célula que cause maior morte celular quando comparado ao ion complexo com carga negativa.

Um parâmetro importante quando se deseja comparar a atividade cit.otòxica de potenciais agentes anti neoplásicos é o valor do IC50. 0 IC50 é o valor de concentração suficiente para morte de 50 % da cultura celular. E desejado que um composto possua elevado valor de IC₅₀ para células sadias e baixo para células neoplásicas.

Em alguns casos não foi possível determinar o valor de IC50 pois este não foi atingido coro a máxima concentração testada (200 μg mL^_1) . Observa-se que os valores de IC50 são extremamente elevados para células sadias o que é um bom sinal porém são relativamente altos para as células neoplásicas, uma vez que busca-se valores na faixa de 8 - 20 μmoL-L^-1 para que os compostos sejam usados comercialmente. Porém considerando-se que células neoplásicas NG97 e PANC1 dificilmente sào afetadas pela maioria dos fármacos o resultado obtido neste trabalho possui relevância, pois os complexos apresentados neste trabalho possuem: alta solubilidade em água, possibilidade de atravessar a parede celular sem auxílio de um transportador, possibilidade de ser utilizado como marcador iuminescente, especificidade contra células neeplásicas do tipo NG97 e PANO e baixa cítotoxicidade contra células sadias.

Exemplo 15 - Ensaio de Transposição da Barreira Hematoencefálica ;

( 104 ) Quando se busca um composto capaz de marcar ou apresentar atividade anti neopiâs.ica contra tumores localizados no cérebro é importante que este composto seja capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica. Para verificação da capacidade de atravessar a membrana hemato- ence.fal.ica foi feito ensaio utilizando procedimento conhecido pelos versados na área, o qual consiste basicamente em reproduzir a barreira hemato-encefàlica e verificar a capacidade ou não do composto de atravessar a mesma.

(105)As células endoteliais HUVEC (ATCC* CRL~l730™ , endotélio vascular de veia umbilical humana) foram plaqueadas en transwell para placas de 24 poços com poro de 3,0 μm. Após as células HUVEC atingirem a confluência o meio da parte superior da transwell foi substituído por meio contendo 200 μmoL-1 do complexo K₃[Eu(Lib)₃l e a mesma foi colocada em placa de 24 poços que continha no fundo laminuia com a linhagem aderida. Após 24 horas as Iaminulas foram fixadas com parafcrmaldeídc 4% por 20 minutos a temperatura ambiente, seguida de la\'agem com PBS e posterior fixação em lâmina por çlicerol 70%. As lâminas foram analisadas em microscópio Upright LSM780-NLO.

(106) Para este ensaio foi utilizada solução contendo o complexo K₃[Eu(L Ib) 3 l com concentração igual a 200 μmol L-1 e tempo de 24 h. Foram feitas imagens da laminuia contendo as células NG97 no fundo do sistema utilizando microscópio confocal e excitação em 405 nm. Figura 1.1.

[107]A luminescência detectada nas Figuras 11(b) e (c) só podem ser oriundas da emissão do complexo K3[Su(I. Ib)3), pois as células do tipo NG9⁷ não apresentam emissão intensa nessa região do espectro (Figura 4(a)). Estes resultados indicam que o complexo K3[Eu(L lb)3] podem atravessar a barreira hemato-encsfálica quando constituída somente por células KUVEC ou por uma dupla camada contendo células HUVEC e NG97 A análise das imagens feitas após 24 h da adição do complexo K3[Eu(L Ib}3) mostra que as células ainda possuem seu contorno bem definido quando comparadas ao padrão (Figura 4(a)) o que mostra que o complexo de fato deve transpor algum tipo de barreira pois do contrário as células teriam perdido seu contorno relativo quando comparado ao padrào. É possível ainda observar que o complexo, neste estágio, tende a se acumular fora do núcleo, com alguns pontos de maior acumulo, Figura 11(b) e Figura 11 (c).