IMAGING DEVICE AND IMAGING METHOD

　以下、添付図面にしたがって本発明の好ましい実施形態について説明する。本発明は以下の好ましい実施形態により説明される。本発明の範囲を逸脱すること無く、多くの手法により変更を行うことができ、実施形態以外の他の実施形態を利用することができる。したがって、本発明の範囲内における全ての変更が請求の範囲に含まれる。

　ここで、図中、同一の記号で示される部分は、同様の機能を有する同様の要素である。また、本明細書中で、数値範囲を“　～　”を用いて表す場合は、“　～　”で示される上限、下限の数値も数値範囲に含むものとする。

　（第１実施形態）
　第１実施形態の画像撮像装置、及び画像撮像方法について、図面を参照して説明する。図１は、本実施形態の画像撮像装置１０の構成図である。図１に示される、画像撮像装置１０は、１回の撮影により、細胞から発光される異なる波長の蛍光を撮像することができるよう構成される。

　画像撮像装置１０は、細胞Ｃに結合された蛍光色素を励起するための第１光源１２と、細胞Ｃを収納する収納部４２を有する容器４０と、容器４０を載置するためのテーブル１４と、フィルター群２４と、細胞Ｃとフィルター群２４との間に配置された対物レンズ１６と、細胞Ｃから発光される蛍光を撮像するための撮像素子２６と、を備える。フィルター群２４は、第１マルチバンドパスフィルター１８、ダイクロイックミラー２０及び第２マルチバンドパスフィルター２２を含む。また、収納部４２は、容器４０の表面に形成される。また、図１の例では、容器４０は、３つの収納部４２を有する。ただし、収納部４２の数は３つに限らず、２つ以下でも良いし、４つ以上でも良い。

　制御部２８は、画像撮像装置１０による撮像を制御する。制御部２８は、テーブル１４、第１光源１２及び撮像素子２６と電気的に接続されている。制御部２８は、テーブル１４、第１光源１２及び撮像素子２６の動作を制御する。

　本実施形態においては、第１光源１２と、フィルター群２４と、撮像素子２６とは、容器４０の裏面側に配置される。したがって、撮像装置１０は、細胞Ｃから発光される異なる波長の蛍光を、容器４０の裏面側から撮像することが可能である。

　但し、これに限定されることなく、第１光源１２と、フィルター群２４と、撮像素子２６とは、容器４０の表面側に配置されても良い。この場合、撮像装置１０は、細胞Ｃから発光される複数の蛍光を、容器４０の表面側から撮像することが可能である。

　画像撮像装置１０により撮像される細胞Ｃは、抗原抗体反応により免疫染色されている。抗原抗体反応とは、抗体が相補的な構造を持つ抗原と特異的に結合することを意味する。免疫染色とは、細胞に存在する抗原に、蛍光色素を連結した抗体を結合させることを意味する。

　蛍光色素は、励起光により励起され蛍光を発光する。なお、励起光により発光する蛍光は、励起光の波長帯域に比べてより長波長側の波長帯域を有する。

　本実施形態においては、細胞Ｃは、免疫染色により、少なくとも複数種の蛍光色素が結合されている。複数種の蛍光色素は、それぞれ異なる波長帯域の励起光により励起され、それぞれ異なる波長の蛍光を発光する。

　免疫染色には、直接法と間接法とがある。直接法は、蛍光色素を直接抗体に結合し、抗原と反応させる方法である。一方、間接法は、検出すべき抗原に特異的に結合できる抗体（１次抗体）には蛍光色素を結合せず、その１次抗体に特異的に結合できる抗体（２次抗体）に蛍光色素を結合して検出する方法である。

　上述したように、細胞Ｃは、抗原抗体反応により免疫染色される。例えば、抗ヒトＣＤ抗体として、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１２７抗体等を例示することができる。蛍光色素として、４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ：４‘，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ：ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ）、ピロニンＹ（Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、フィコエリスリン（ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ：ａｌｌｏｐｈｉｃｏｃｙａｎｉｎ）、テキサスレッド（ＴＲ（登録商標））、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、Ｃｙ３（２‘－Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ　５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｃｙ５（Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ）、ＤＲＡＱ５（登録商標）（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５７０、及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１等を挙げることができる。

　細胞Ｃは、複数の収納部４２を有する容器４０の少なくとも一つの収納部４２に収納され保持される。収納部４２は、容器４０を凹設して形成されている。収納部４２は、開口４４と側面４６と平坦な保持面４８を有している。平坦な保持面４８は、細胞Ｃを保持する。収納部４２の側面４６は、保持面４８から開口４４に向かって広がる傾斜構造である。側面４６を傾斜構造とすることにより、細胞Ｃを収納部４２内に容易に収納させることができる。なお、保持面４８は、細胞Ｃを保持する箇所が平坦であれば良い。

　収納部４２の細胞Ｃの保持面４８が平坦であるので、細胞Ｃを撮像する際に、細胞全体に焦点を合わせることが容易となり、細胞Ｃの撮像を確実に行うことが可能となる。

　容器４０に用いられる材料としては、ポリメチルメタクリレートなどのポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ＡＢＳ（Acrylonitrile、Butadiene、Styrene共重合剛性樹脂）、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートなどの芳香族ポリエステル、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなどの各種ポリオレフィン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリ乳酸、ポリパーフルオロアルコキシ樹脂のような熱可塑性剛性樹脂、ポリジメチルシロキサンなどの熱硬化性剛性樹脂、及びポリテトラフルオロエチレン等を用いることが可能である。

　本実施形態の画像撮像装置１０は、容器４０を任意の位置に移動（例えば、Ｘ方向、Ｙ方向、及びＺ方向）させるため、テーブル１４と駆動装置（不図示）とを備えていることが好ましい。テーブル１４と駆動装置とにより、容器４０の細胞Ｃを収納する収納部４２を、観察位置に移動させることができる。駆動装置は、テーブル１４を、Ｘ方向、Ｙ方向、及びＺ方向に移動できることが好ましい。

　第１光源１２は、複数の波長の光を同時に発光することができる。第１光源１２は、複数の波長の光を同時に発光することができれば、その構造、方式等は特に限定されない。第１光源１２は、１個の光源により構成され、１個の光源から複数の波長の光が発光されても良い。第１光源１２が波長の異なる光を発光する複数の光源により構成され、複数の光源から複数の波長の光が発光されても良い。また、同時とは、細胞Ｃを撮像する際に、複数の波長の光が含まれていることを意味し、複数の波長の光が同時に発光されても、別々に発光されても良い。

　第１光源１２として、特に限定されないが、例えば、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、発光ダイオード、レーザダイオード、タングステンランプ、ハロゲンランプ、及び白色発光ダイオード等を用いることができる。第１光源１２が複数の波長の光を同時に発光することができるので、細胞Ｃの複数種の蛍光色素を励起する複数の波長の励起光を選択的に発光することが可能となる。

　フィルター群２４は、第１マルチバンドパスフィルター１８、ダイクロイックミラー２０及び第２マルチバンドパスフィルター２２を含んでいる。

　第１マルチバンドパスフィルター１８は、第１光源１２の発光側に対向する位置において、第１光源１２からの光の進行方向に対して約９０°傾けられて配置される。第１マルチバンドパスフィルター１８は、励起フィルターとして機能する。励起フィルターは、第１光源１２から発光される複数の波長の光のうち蛍光色素を励起する波長の光を選択的に透過させ、その他の波長の光をカットする光学部材である。

　励起フィルターを構成する第１マルチバンドパスフィルター１８は、第１光源１２から発光される複数の波長の光の中から、細胞Ｃに結合された蛍光色素を励起する複数の波長の励起光（少なくとも２以上の波長の励起光）のみを選択的に透過するよう構成される。第１マルチバンドパスフィルター１８は、例えば、ガラス基板と、屈折率の異なる誘電体の多層膜とにより構成することが可能である。

　ダイクロイックミラー２０は、第１マルチバンドパスフィルター１８を透過した複数の波長の励起光の進行方向に対して約４５°傾けられて配置される。ダイクロイックミラー２０は、複数の波長の励起光を反射し、細胞Ｃに向けて照射するよう構成される。また、ダイクロイックミラー２０は、複数の波長の励起光により励起された細胞Ｃに結合された複数種の蛍光色素が発光する異なる波長の蛍光を透過するよう構成される。すなわち、ダイクロイックミラー２０は、励起光と蛍光とを分離するための光学部材である。

　励起光により発光する蛍光は、励起光の波長帯域に比べて、長波長側の波長帯域を有するので、ダイクロイックミラー２０を使用することにより、蛍光のみを透過させることが可能となる。ダイクロイックミラー２０は、例えば、ガラス基板と、屈折率の異なる誘電体の多層膜とにより構成することが可能である。

　第２マルチバンドパスフィルター２２は、ダイクロイックミラー２０を透過した異なる波長の蛍光の進行方向に対して約９０°に傾けられて配置される。第２マルチバンドパスフィルター２２は、蛍光フィルターとして機能する。蛍光フィルターは、細胞Ｃから発光される異なる波長の蛍光から必要な波長帯域の蛍光のみを透過し、その他の光をカットする光学部材である。

　蛍光フィルターを構成する第２マルチバンドパスフィルター２２は、励起光を透過させず、細胞Ｃから発光される異なる波長の蛍光のみを透過させることが可能である。第２マルチバンドパスフィルター２２は、例えば、ガラス基板と、屈折率の異なる誘電体の多層膜とにより構成することが可能である。

　対物レンズ１６は、ダイクロイックミラー２０から反射される励起光を集光し、かつ細胞Ｃから発光される蛍光を拡大させるため、フィルター群２４と細胞Ｃとの間に配置される。対物レンズ１６として、光学測定に使用されるレンズを用いることができる。

　撮像素子２６は、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過した異なる波長の蛍光を撮像する。撮像素子２６は、ダイクロイックミラー２０を透過する異なる波長の蛍光の進行方向に対して約９０°傾けられて配置される。撮像素子２６は、受光した光を電気信号に変換する電子デバイスである。

　図２は、撮像素子２６の部分拡大図である。撮像素子２６は、図２に示されるように、複数の画素２６０を含んでいる。１個の画素２６０は、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４を有している。すなわち、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４により１個の画素２６０が構成される。

　本実施形態では、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４の大きさが同じ大きさである場合を例示したが、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４の大きさを適宜変更することができる。また、本実施形態では、１個の画素２６０は、４つの副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４を有する場合を例示したが、１個の画素２６０は、３つの副画素を有しても良いし、５つ以上の副画素を有しても良い。

　撮像素子２６の複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４により得られた蛍光の強度は、制御部２８により演算処理され、１個の画素２６０としての蛍光の強度が算出される。

　例えば、撮像素子２６を単板式のカラー撮像素子として機能させる場合、１個の画素２６０の上に赤色フィルター、緑色フィルター、及び青色フィルターを配列することにより、１個の画素２６０に複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４を含ませることができる。赤色フィルター、緑色フィルター、及び青色フィルターは、それぞれの色のみを透過させる光学フィルターである。単板式のカラー撮像素子とは、赤色フィルター、緑色フィルター、及び青色フィルターを設けた１個の撮像素子において、カラー画像を取得する撮像素子である。

　赤色フィルター、緑色フィルター、及び青色フィルターを配列する際、例えば、副画素２６１、及び２６４に緑色フィルターを配列し、副画素２６２に青色フィルターを配列し、副画素２６３に赤色フィルターを配列することが好ましい。但し、これに限定されず、配列は適宜変更が可能である。

　副画素を構成する例として光学フィルターを示したが、これに限定されない。例えば、位相差画像を撮像するため、少しずつずらした回折格子を４個の副画素を１画素とする位相差カメラであっても良い。

　次に、上述のように構成された画像撮像装置１０による画像撮像方法について、第１光源１２が、緑色発光ダイオード、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードから構成される場合を例に説明する。

　まず、細胞Ｃは、免疫染色により異なる波長の蛍光を発光する複数種の蛍光色素で染色される。次に、収納するステップでは、細胞Ｃは、平坦な表面に保持面４８を有する複数の収納部４２を有する容器４０の少なくとも１個の収納部４２の保持面４８に収納される。

　次に、発光するステップでは、第１光源１２を構成する緑色発光ダイオード、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードを同時に発光させる。これにより、第１光源１２から複数の波長の光を同時に発光させる。

　図３は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第１光源１２から同時に発光される複数の波長の光のスペクトルのグラフである。緑色発光ダイオードは４９０ｎｍ以上５６０ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する緑色光Ｇを発光する。また、青色発光ダイオードは４３０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する青色光Ｂを発光する。また、紫色発光ダイオードは３８０ｎｍ以上４３０ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する紫色光Ｖを発光する。

　第１光源１２から同時に発光される複数の波長の光は、緑色発光ダイオード、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードから発光される各色の光に限定されない。第１光源１２から同時に発光される複数の波長の光は、細胞Ｃに結合される蛍光色素に対する励起光に応じて適宜選択することが可能である。

　本実施形態では、緑色光Ｇ、青色光Ｂ、及び紫色光Ｖの相対出力は、一定とされているが、限定されない。例えば、制御部２８は、緑色発光ダイオード、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードの光量を、それぞれ独立に制御する。これにより、画像撮像装置１０は、撮像対象である細胞Ｃから発光される蛍光の強度を変更でき、細胞Ｃから発光される蛍光をより精度良く撮像できる。

　次に、第１光源１２から発光される複数の波長の光のうち細胞Ｃに結合される蛍光色素を励起する複数の波長の励起光は、第１マルチバンドパスフィルター１８を透過する。図４は、透過率（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第１マルチバンドパスフィルター１８の分光スペクトルを示すグラフである。図４に示されるように、第１マルチバンドパスフィルター１８は、緑色光Ｇ、青色光Ｂ、及び紫色光Ｖそれぞれの波長帯域より狭い波長帯域のみを透過させるＦ１Ｇ、Ｆ１Ｂ、及びＦ１Ｖの分光スペクトルを備え、トリプルバンドパスフィルターとして構成することができる。

　第１マルチバンドパスフィルター１８は、第１光源１２から発光される複数の波長の光の中から、３つの波長の励起光を透過する。図５は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、３つの励起光のスペクトルのグラフである。第１マルチバンドパスフィルター１８は、緑色発光ダイオードから照射される緑色光Ｇより狭帯域の励起光ＥＧを透過させる。また、第１マルチバンドパスフィルター１８は、青色発光ダイオードから照射される青色光Ｂより狭帯域の励起光ＥＢを透過させる。また、第１マルチバンドパスフィルター１８は、紫色発光ダイオードから照射される紫色光Ｖより狭帯域の励起光ＥＶを透過させる。

　図６は、透過率（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、ダイクロイックミラー２０の分光スペクトルを示すグラフである。図６に示されるように、ダイクロイックミラー２０の分光特性によれば、励起光ＥＧ、ＥＢ、及びＥＶに対応する波長帯域の透過率が低く設定されている。このため、複数の励起光ＥＧ、ＥＢ、及びＥＶは、ダイクロイックミラー２０により反射され、細胞Ｃに向けて照射される。

　複数の励起光ＥＧ、ＥＢ、及びＥＶが、細胞Ｃに結合された複数種の蛍光色素を励起することにより、細胞Ｃに結合された複数種の蛍光色素が異なる波長の蛍光を発光する。図７は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、３つの励起光ＥＧ、ＥＢ及びＥＶにより励起された複数種の蛍光色素から発光される３つの蛍光λ１Ｇ、λ１Ｂ及びλ１Ｖのスペクトルのグラフである。図７に示されるように、蛍光λ１Ｇ、λ１Ｂ及びλ１Ｖは、それぞれ、励起光ＥＧ、ＥＢ及びＥＶより長波長側の波長帯域を有する。

　蛍光λ１Ｇ、λ１Ｂ及びλ１Ｖは、対物レンズ１６、及び図６に示される分光特性を有するダイクロイックミラー２０を透過し、第２マルチバンドパスフィルター２２に到達する。ここで、図６に示されるとおり、ダイクロイックミラー２０の分光特性によれば、蛍光λ１Ｇ、λ１Ｂ及びλ１Ｖの波長帯域の透過率が高い。したがって、蛍光λ１Ｇ、λ１Ｂ及びλ１Ｖは、ダイクロイックミラー２０を透過する。図８は、透過率（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第２マルチバンドパスフィルター２２の分光スペクトルを示すグラフである。図８に示されるように、第２マルチバンドパスフィルター２２は、蛍光λ１Ｇ、λ１Ｂ及びλ１Ｖの波長帯域より狭い波長帯域の光を透過させるＦ２Ｇ、Ｆ２Ｂ及びＦ２Ｖの分光スペクトルを備え、トリプルバンドパスフィルターとして構成することができる。

　細胞Ｃから発光されダイクロイックミラー２０を透過した蛍光λ１Ｇは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過することにより、必要ない波長帯域の光がカットされる。細胞Ｃから発光されダイクロイックミラー２０を透過した蛍光λ１Ｂは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過することにより、必要ない波長帯域の光がカットされる。細胞Ｃから発光されダイクロイックミラー２０を透過した蛍光λ１Ｖは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過することにより、必要ない波長帯域の光がカットされる。図９は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過した蛍光λ２Ｇ、λ２Ｂ及びλ２Ｖのスペクトルのグラフである。蛍光λ１Ｇは、第２マルチバンドパスフィルター２２により不要な波長帯域がカットされ、蛍光λ１Ｇより波長帯域が狭い蛍光λ２Ｇが第２マルチバンドパスフィルター２２から出力される。また、蛍光λ１Ｂは、第２マルチバンドパスフィルター２２により不要な波長帯域がカットされ、蛍光λ１Ｂより波長帯域が狭い蛍光λ２Ｂが第２マルチバンドパスフィルター２２から出力される。また、蛍光λ１Ｖは、第２マルチバンドパスフィルター２２により不要な波長帯域がカットされ、蛍光λ１Ｖより波長帯域が狭い蛍光λ２Ｖが第２マルチバンドパスフィルター２２から出力される。

　次に、撮像するステップでは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過した蛍光λ２Ｇ、λ２Ｂ及びλ２Ｖは、１画素に複数の副画素を有する撮像素子２６により撮像される。本実施形態では、撮像素子２６は、赤色フィルター、緑色フィルター及び青色フィルターにより副画素を構成する単板式のカラー撮像素子を用いることができる。図１０は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、副画素を構成する赤色フィルター、緑色フィルター及び青色フィルターを有する撮像素子２６の感度特性のグラフである。例えば、赤色フィルターは５５５ｎｍ以上７００ｎｍ以下の波長帯域の光を透過し、緑色フィルターは４７０ｎｍ以上６０５ｎｍ以下の波長帯域の光を透過し、青色フィルターは３７５ｎｍ以上５１０ｎｍ以下の波長帯域の光を透過する。但し、赤色フィルター、緑色フィルター及び青色フィルターが透過する波長帯域は、適宜選択することができる。

　撮像素子２６により撮像された蛍光の強度が、例えば、制御部２８に入力され、記憶される。制御部２８により蛍光の強度が演算処理され、カラーの画像が取得される。

　図１１は、撮像素子２６により取得された蛍光の強度に基づいて制御部２８により取得された細胞Ｃから発光された蛍光の画像の概念図である。例えば、白血球６０と、有核赤血球７０と、赤血球８０が表示されている。白血球６０においては、その表面６２は蛍光色素により青色に発光し、内部の核６４は蛍光色素により赤色に発光している。有核赤血球７０においては、その表面７２は蛍光色素により緑色に発光し、内部の核７４は蛍光色素により赤色に発光している。赤血球（幼弱）８０においては、その表面８２は蛍光色素により緑色に発光している。一方、内部の核を有していないので、赤血球８０は赤色に発光していない。

　本実施形態では、上述した、細胞Ｃから発光される異なる波長の蛍光を１回の撮影により、同時に撮像することができるので、細胞Ｃの撮像時間を短縮することができる。

　（第２実施形態）
　図１２に示される第２実施形態の画像撮像装置、及び画像撮像方法について、図面を参照して説明する。画像撮像装置１０は、１回の撮影により、細胞からの複数の蛍光と明視野像を撮像することができるよう構成される。なお第１実施形態の構成と同様の構成には同一符号を付して説明を省略する場合がある。

　画像撮像装置１０は、細胞Ｃに結合された蛍光色素を励起するための第１光源１２と、細胞Ｃを収納する収納部４２を有する容器４０と、容器４０を載置するためのテーブル１４と、フィルター群２４と、細胞Ｃとフィルター群２４との間に配置された対物レンズ１６と、細胞Ｃを透過する透過光を細胞Ｃに照射する第２光源５０と、細胞Ｃから発光される蛍光及び細胞Ｃを透過した透過光を撮像するための撮像素子２６と、を備える。本実施形態においても、実施形態１と同様に、フィルター群２４は、第１マルチバンドパスフィルター１８、ダイクロイックミラー２０及び第２マルチバンドパスフィルター２２を含む。また、収納部４２は、容器４０の表面に形成される。また、図１２の例では、容器４０は、３つの収納部４２を有する。ただし、収納部４２の数は３つに限らず、２つ以下でも良いし、４つ以上でも良い。また、第２光源５０は、容器４０の表面側に配置され、第１光源１２は、容器４０の裏面側に配置される。すなわち、第２光源５０は、容器４０に形成される収納部４２に対して第１光源とは反対側に配置される。

　制御部２８は、画像撮像装置１０による撮像を制御する。制御部２８は、テーブル１４、第１光源１２、撮像素子２６及び第２光源５０と電気的に接続されている。制御部２８はテーブル１４、第１光源１２、撮像素子２６及び第２光源５０の動作を制御する。

　本実施形態では、第１実施形態と同様に異なる波長の蛍光を、容器４０の裏面側から撮像することが可能である。さらに、明視野像も容器４０の裏面側から撮像することが可能である。但し、これに限定されることなく、細胞Ｃから発光される異なる波長の蛍光、及び細胞Ｃの明視野像を、容器４０の表面側から撮像することが可能である。

　第１実施形態と同様に、第１光源１２は、複数の波長の光を同時に発光することができる。第１光源１２は、複数の波長の光を同時に発光することができれば、その構造、方式等は特に限定されない。

　第１光源１２は、緑色発光ダイオード、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードの群から選択される２つの発光ダイオードを含むことが好ましい。２つの発光ダイオードから波長の異なる光を発光することにより、細胞Ｃに結合された蛍光色素から異なる２つの波長の蛍光を発光させることができる。

　第２光源５０は、細胞Ｃの蛍光色素を励起させる励起光、及び蛍光色素から発光される蛍光と異なる波長の光を発光することができれば、その構造、方式等は特に限定されない。第２光源５０として、特に限定されないが、例えば、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、発光ダイオード、レーザダイオード、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色発光ダイオード等を用いることができる。第２光源５０から発光される光の波長帯域が細胞Ｃの蛍光色素を励起する励起光または蛍光色素から発光される蛍光と同じ波長を含む場合、細胞Ｃと第２光源５０との間にバンドパスフィルター（不図示）を設けることにより、細胞Ｃの蛍光色素を励起する励起光及び蛍光色素から発光される蛍光と異なる波長の光を細胞Ｃに照射することができる。

　第１実施形態と同様に、フィルター群２４は、第１マルチバンドパスフィルター１８、ダイクロイックミラー２０及び第２マルチバンドパスフィルター２２を含んでいる。

　第１マルチバンドパスフィルター１８は光学部材である励起フィルターとして機能し、ダイクロイックミラー２０は、励起光と蛍光を分離するための光学部材として機能し、第２マルチバンドパスフィルター２２は光学部材である蛍光フィルターとして機能する。

　さらに、第２実施形態では、ダイクロイックミラー２０、及び第２マルチバンドパスフィルター２２は、第２光源５０から照射され細胞Ｃを透過した透過光を透過する。細胞Ｃを透過した第２光源５０からの透過光が明視野像を構成する。また、透過光光源である第２光源５０の直前に位相差用コンデンサ（ドーナツ型スリット）を配置し、対物レンズに位相リングを追加した位相差観察用レンズに変更して、明視野像を位相差像として取得することもできる。

　対物レンズ１６は、ダイクロイックミラー２０から照射される励起光を集光し、かつ細胞Ｃから発光される蛍光、及び透過光を拡大させるため、フィルター群２４と細胞Ｃとの間に配置される。対物レンズ１６として、光学測定に使用されるレンズを用いることができる。

　撮像素子２６は、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過した異なる波長の蛍光と一つの波長の透過光とを撮像する。撮像素子２６は、第１実施形態と同様の構成にすることができ、図２に示されるように、複数の画素２６０を含んでいる。１個の画素２６０は、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４を有している。すなわち、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４により１個の画素２６０が構成される。なお、本実施形態にあっても、第１実施形態と同様に、複数の副画素２６１、２６２、２６３、及び２６４の大きさを適宜変更しても良い。また、１個の画素２６０は、３つの副画素を有しても良いし、５つ以上の副画素を有しても良い。

　次に、上述のように構成された画像撮像装置１０による画像撮像方法について、第１光源１２が、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードを含む光源であり、第２光源５０が赤色発光ダイオードである場合を例に説明する。まず、細胞Ｃは、蛍光色素で染色され、保持面４８に保持される。

　発光するステップでは、第１光源１２を構成する青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードを同時に発光させることにより、第１光源１２から複数の波長の光を同時に発光させる。

　図１３は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第１光源１２から同時に発光される複数の波長の光のスペクトルのグラフである。青色発光ダイオードは４７０ｎｍのピーク波長を有する青色光Ｂを発光する。また、紫色発光ダイオードは４０５ｎｍのピーク波長を有する紫色光Ｖを発光する。

　第１光源１２から同時に発光される複数の波長の光は、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードから発光される各色の光に限定されない。細胞Ｃに結合される蛍光色素に対する励起光に応じて適宜選択することが可能である。

　第１実施形態と同様に、制御部２８は、青色発光ダイオード、及び紫色発光ダイオードの光量を、それぞれ独立に制御することが可能である。

　次に、第１光源１２から発光される複数の波長の光のうち細胞Ｃに結合される蛍光色素を励起する複数の波長帯域の励起光は、第１マルチバンドパスフィルター１８を透過する。図１４は、透過率（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第１マルチバンドパスフィルター１８の分光スペクトルを示すグラフである。図１４に示されるように、第１マルチバンドパスフィルター１８は、青色光Ｂ、及び紫色光Ｖそれぞれの波長帯域より狭い波長帯域のみを透過させるＦ１Ｂ、及びＦ１Ｖの分光スペクトルを備え、デュアルバンドパスフィルターとして構成することができる。なお、後述の透過光のスペクトルと重なることがなければ図４のように緑光Ｆ１Ｇの分光スペクトルがあっても良い。

　第１マルチバンドパスフィルター１８は、第１光源１２から発光される複数の波長の光の中から、２つの波長の励起光を透過させる。図１５は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、２つの励起光のスペクトルのグラフである。第１マルチバンドパスフィルター１８は、青色発光ダイオードから照射される青色光Ｂより狭帯域の励起光ＥＢを透過させる。また、第１マルチバンドパスフィルター１８は、紫色発光ダイオードから照射される紫色光Ｖより狭帯域の励起光ＥＶを透過させる。

　図１６は、透過率（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、ダイクロイックミラー２０の分光スペクトルを示すグラフである。図１６に示されるように、ダイクロイックミラー２０の分光特性によれば、励起光ＥＢ、及びＥＶに対応する波長帯域の透過率が低く設定されているので、複数の励起光ＥＢ、及びＥＶはダイクロイックミラー２０により反射され、細胞Ｃに向けて照射される。なお、後述の透過光のスペクトルと重なることがなければ図６のように５２０ｎｍ～５５０ｎｍに透過しない領域があっても良い。

　複数の励起光ＥＢ、及びＥＶが、細胞Ｃに結合された複数種の蛍光色素を励起することにより、細胞Ｃに結合された複数種の蛍光色素が異なる波長の蛍光を発光する。図１７は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、２つの励起光ＥＢ、及びＥＶにより励起された複数種の蛍光色素から発光される蛍光λ１Ｂ及びλ１Ｖと、第２光源５０からの透過光Ｒのスペクトルのグラフである。図１７に示されるように、蛍光λ１Ｂ及びλ１Ｖは、それぞれ、励起光ＥＢ及びＥＶより長波長側の波長帯域を有する。さらに、第２光源５０からの透過光Ｒは、蛍光λ１Ｂ及びλ１Ｖとは異なる波長帯域を有することが理解できる。透過光Ｒ、蛍光１λＢ及びλ１Ｖが異なる波長帯域を有しているので、後述するように、撮像素子２６において、２つの蛍光と１つの透過光を撮像することができる。

　蛍光λ１Ｂ及びλ１Ｖ、透過光Ｒは、対物レンズ１６、及び図１６に示される分光特性を有するダイクロイックミラー２０を透過し、第２マルチバンドパスフィルター２２に到達する。ここで、図１６に示されるとおり、ダイクロイックミラー２０の分光特性よれば、蛍光λ１Ｂ、λ１Ｖ及び透過光Ｒの波長帯域の透過率が高い。したがって、蛍光λ１Ｂ、λ１Ｖ及び透過光Ｒは、ダイクロイックミラー２０を透過する。図１８は、透過率（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第２マルチバンドパスフィルター２２の分光スペクトルを示すグラフである。図１８に示されるように、第２マルチバンドパスフィルター２２は、蛍光λ１Ｂ及びλ１Ｖと透過光Ｒの波長帯域より狭い波長帯域のみを透過させるＦ２Ｂ、Ｆ２Ｖ及びＦＲの分光スペクトルを備え、トリプルバンドパスフィルターとして構成することができる。

　細胞Ｃから発光されダイクロイックミラー２０を透過した蛍光λ１Ｂは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過することにより、必要ない波長帯域の光がカットされる。細胞Ｃから発光されダイクロイックミラー２０を透過した蛍光λ１Ｖは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過することにより、必要ない波長帯域の光がカットされる。細胞Ｃ及びダイクロイックミラー２０を透過した透過光Ｒは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過することにより、必要ない波長帯域の光がカットされる。図１９は、相対出力（％）を縦軸、波長（ｎｍ）を横軸とする、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過した蛍光及び透過光のスペクトルのグラフである。蛍光λ１Ｂは、第２マルチバンドパスフィルター２２により不要な波長帯域がカットされ、蛍光λ１Ｂより波長帯域が狭い蛍光λ２Ｂが第２マルチバンドパスフィルター２２から出力される。また、蛍光λ１Ｖは、第２マルチバンドパスフィルター２２により不要な波長帯域がカットされ、蛍光λ１Ｖより波長帯域が狭い蛍光λ２Ｖが第２マルチバンドパスフィルター２２から出力される。また、透過光Ｒは、第２マルチバンドパスフィルター２２により不要な波長帯域がカットされ、透過光Ｒより波長帯域が狭い透過光λＲが第２マルチバンドパスフィルター２２から出力される。

　撮像するステップでは、第２マルチバンドパスフィルター２２を透過した蛍光λ２Ｂ及びλ２Ｖと、透過光λＲは、１画素に複数の副画素を有する撮像素子２６により撮像される。撮像素子２６として、第１実施形態と同様の赤色フィルター、緑色フィルター及び青色フィルターとを有する単板式のカラー撮像素子を用いることができる。

　撮像素子２６により撮像された蛍光の強度と透過光の強度とが、例えば、制御部２８に入力され、記憶される。制御部２８により蛍光の強度と透過光の強度とが演算処理され、カラーの画像が取得される。

　図２０は、撮像素子２６により取得された蛍光の強度に基づいて制御部２８により取得された細胞Ｃから発光された蛍光と位相差像の画像の概念図である。図２０には、有核赤血球７０が表示されている。有核赤血球７０では、幼弱な赤血球の蛍光は赤血球全体に均一に蛍光しないで局所的に蛍光する場合がある。この場合、蛍光では有核赤血球７０の形状を把握することができない。このような場合に明視野像を撮影し重ねることで形状も知ることができる。明視野像はさらに位相差像を得ることでより形状の把握が明瞭になるので好ましい。

　図２０においては、有核赤血球７０の内の核７４が、例えば、蛍光色素により青色に発光し、有核赤血球７０の内のＨｂＦ７６（胎児ヘモグロビン）が、蛍光色素により緑色に発光している。有核赤血球７０の外形形状７９については、透過光を利用して位相差像が撮像されている。

　本実施形態では、上述した、細胞Ｃから発光される異なる波長の蛍光と第２光源からの透過光を１回の撮影により、同時に撮像することができるので、細胞Ｃの撮像時間を短縮することができる。