COMPOSITION FOR ENHANCING SENSITIVITY TO ANTI-CANCER AGENT TARGETING EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER

이하 본 발명의 바람직한 실시를 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 기술된 실시 예에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 하기에 설명되는 본 발명의 실시 예는 당업자에게 본 발명의 사상을 충분하게 전달하기 위한 것임에 유의하여야 한다.

실시예 1: 실험 방법 및 재료

1-1: 황련 추출물의 제조

동국대학교 일산병원(Kyunggi-do, South Korea)에서 구입하여 동국대학교 김은정 교수(한의학전공)의 감정 하에 선별된 황련을 정선하여 사용하였다. 황련 10g을 환류 냉각관을 부착한 3L 원형 플라스크에 담고 10배수(w/v)의 용매(물, 에탄올)를 가하여 실온에 24시간 두어 추출한 후, 4시간 동안 끓는점 이하의 온도(열수 추출은 90℃, 에탄올 추출은 70℃)에서 추출하였다. 추출액은 0.2μm 포어 크기의 와트판 페이퍼를 이용하여 여과하고, 여과액은 회전식 진공농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압농축하였다. 이후 동결건조기(EYELA, Japan)를 사용하여 동결건조하여 시료로 사용하였다. 얻어진 추출물의 무게와 수율은 에탄올용매 1.26g/12.6% 이었다. 동결 건조한 황련추출물은 in vitro 세포 실험을 위해서는 1000ug/mL 의 농도로 RPMI에 녹였고, in vivo 동물 실험을 위해서는 6mg/mL의 농도로 DMSO에 녹여서 각 실험의 농도에 맞게 조정하여 이용하였다.

1-2: 시약

EGFR-TKI, 제프티닙 (Gefitinib)은 Selleck chemical로부터 구입하였다. EGFR, AKT, p-AKT, Caspase 3, PARP에 대한 항체는 Cell signaling technology로부터 구입하였다. p-EGFR, MET, BCL2, MCL-1, BCL-xl과 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다. 2차 항체인 고트 항-마우스 IgG와 고트 항-토끼 IgG는 Santa Cruz biotechnology로부터 구입하였다.

1-3: 세포 배양

인간 정상 폐 상피세포주인 BEAS-2B 및 인간 비소세포폐암 세포주 PC9, PC9GR, A549, A549GR, HCC827 은 각각 울산대학교 아산병원 노진경 박사로부터 제공받았다. HCC828GRKU는 고려대학교에서 구축하였다. 여기서 PC9GR, A549GR, 및 HCC827GRKU 세포는 각각 차례대로 PC9, A549, 및 HCC827 제프티닙 저항성 비소세포폐암 세포주이다. 베르베린은 시그마로부터 구입하였다. 10% FBS (fetal bovin serum, Welgene)과 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)이 첨가된 RPMI 배지 (Welgene)에서 5% CO2 배양기로 37℃에서 세포를 유지하며 배양하였다.

1-4: 세포 생존 및 약물의 독성 분석

세포 생존률은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 분석을 이용하여 수행하였다. 세포 (1x10³)를 96웰 세포배양 플레이트에 접종하여 하루 밤을 배양한 후 해당하는 시약인 EGFR-TKI (제프티닙) 또는 황련 추출물 또는 베르베린을 처리 또는 처리하지 않는다. 세포배양 시작 72시간 후에 50uL의 MTT 용액 (0.5mg/ml) (Sigma-aldrich)를 첨가한다. 추가로 4시간 배양한 후에 MTT용액을 제거하고 dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 추가하였다. 마이크로 플레이터 리더 (SpectraMax Plus 384)를 이용하여 570nm의 흡광도를 특정하였다. 약물 조합효과는 CompuSyn Software(www.combosyn.com)를 이용하여 Fa(fraction affected)와 CI (combinatin index) 값을 구하여 측정되었다. CI 값이 <1 경우 상호보완 (시너지) 효과 , 1인 경우 추가 (addicitve), >1인 경우 반대 (antagonism)를 의미한다.

1-5: 세포 이동 분석

세포 이동은 창상치유(wound healing) 분석을 이용하여 수행하였다. 세포 (5x10⁵)를 6 웰 플레이트에 접종한 후 24 시간 배양한 후, 멸균된 마이크로파이펫 팁으로 단충인 세포를 긁는다. 세포를 PBS로 씻어낸 후 정해진 양의 약물(실시예1-1의 황련 추출물)을 첨가한다. 이 시점을 기준점으로 하여 정해진 시간 동안 창상이 치유되는 정도를 현미경으로 관찰한 후, 창상이 치유되는 정도를 비교하였다.

1-6: 세포 침윤 분석

Polycarbonate nucleopore membrane (Costar)을 가진 트랜스웰 챔버(transwell chambers)를 이용하여 침윤 분석을 수행하였다. 미리 코팅된 필터 [6.5mm in diameter, 8-㎛ pore size, Matrigel (100 ㎍/cm2)]는 100㎕ 배지로 재수화하였다. 다음으로, 1*?*⁵세포를 각 챔버의 상단에 접종한 반면, 하단에는 상기 배지 600㎕를 채웠다. 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후, 필터 상단 표면상의 비침습된 세포는 면봉으로 걷어냈고, 필터 하단 표면상의 침습된 세포는 고정시켰으며, 헤마톡실린/에오신 염색하였다. 침습성은 웰 당 5개 임의의 현미경 영역에서 세포를 계수하여 측정하였고, 칩습 범위는 현미경 영역 당 세포의 평균 개수로 나타냈다.

1-7: 유세포 분석

세포 주기 분포를 시험하기 위해서, 단일세포로 해리된 세포들은 75% 에탄올로 고정시켰고, 적어도 1시간 이상 -20℃에서 반응시켰으며, PBS로 세 번 씻어냈다. 그 후, 0.1 mg/mL RNase-A, 50 mg/mL 프로피디움 이오다이드(propidium iodide) 및 0.05% Triton X-100이 포함된 PBS에 상온에서 40분 동안 재현탁하였고, PBS로 씻어낸 후, FACS Canto 2 (Becton Dickinson)로 분석하였다.

1-8: 세포 사멸 분석

세포 사멸은 말단 디옥시뉴클레오디딜 전이효소 dUTP 닉-말단 표지(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) 분석에 의해서 수행되었다. 완전배지가 함유된 커버슬라이드에 세포를 접종하였고, 황련 추출물을 첨가 또는 미첨가하였다. 배양 24, 48시간 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 4℃에서 10분 동안 고정시켰고, 상온에서 PBS로 2번 씻어냈다. 그 후, 세포들을 PBS에 녹인 0.2% Triton X-100으로 상온에서 5분 동안 투과시켰고, PBS로 2번 씻어냈다. 염색된 세포들은 제조사의 프로토콜에 따라 형광 현미경으로 확인하였다(DeadEndTM Fluorometric TUNEL System; Promega).

1-8: 역전사-중합효소 연쇄반응

총 RNA(1 ㎍/㎕)는 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol (Molecular Research Center)을 이용하여 세포로부터 분리하였다. 상보적 DNA (Complimentary DNA; cDNA) 는 cDNA 합성 키트 (Applied biosystmes)를 이용하여 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열은 다음과 같다:

BCL2 sense: 5′-AAGGGGGAAACACCAGAATC-3′(서열번호 1),

BCL2 antisense: 5′-ATCCTTCCCAGAGGAAAAGC-3′(서열번호 2);

MCL-1 sense: 5′-TGCTGGAGTAGGAGCTGGTT-3′(서열번호 3),

MCL-1antisense: 5′-CCTCTTGCCACTTGCTTTTC-3′(서열번호 4),

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) sense: 5′-GCCATCGTCACCAACTGGGAC-3′(서열번호 5),

GAPDH antisense: 5′-CGATTTCCCGCTCGGCCGTGG-3′(서열번호 6).

1-8: 웨스턴 블랏 분석

세포는 1×버퍼 [50mM Tris-HCl, pH 7.4, 100mM NaCl, 5mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid ), 0.5% Nonidet P-40 및 protease inhibitor cocktail tablet (Roche)]에 용해시켰고, Bio-Rad protein assay reagent (Bio-Rad)로 단백질의 농도를 측정하였다. 총 단백질 분주물 (aliquot) (30mg protein/lane)은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)으로 분리하였고, 100 V에서 2시간 동안 니트로셀룰로스 멤브레인 (Millipore)으로 전기이동시켰다. 멤브레인은 TBST [20mM Tris-HCl (pH 7.6), 137mM NaCl, and 0.01% Tween 20]에 녹인 5% BSA로 1시간 동안 상온에서 차단한 후, 1차 항체로 밤새도록 4℃에서 반응시켰다. 멤브레인을 TBST을 이용하여 집중적으로 씻어낸 후, 멤브레인을 과산화효소(horseradish peroxidase)로 접합된 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 탐침 (probe)시켰다. TBST로 15분 동안 세 번 씻어낸 후, 멤브레인은 제조사의 프로토콜에 따라 화학발광(Amersham)에 의해 가시화되었다.

1-9: 제브라피쉬(Zebra fish)를 이용한 제노그라프트 (Xenograft) 모델에서 생체내 (in vivo) 황련 추출물의 효능 분석

제브라피쉬와 그 배아의 유지와 배양은 표준유지과정을 따라 실험하였다. 실험에서 사용된 제브라피쉬 모델은 혈관내피세포에서 초록빛 형광이 발현되는 형질전환 모델인 Tg (Flk1:EGFP) 을 사용하였다. 제브라피쉬으로 도입되는 폐암 세포의 염색은 세포의 지방질을 염색하는 CM-Dil 형광염색물질을 이용하여 염색하였다. 세포는 CM-Dil (4 ng/ml) 이 포함된 DPBS에 37℃에서 4분 후, 4℃에서 15분간 염색 반응을 진행하였다. 염색된 세포는 1000rpm에서 3분 동안 원심분리 후 RPMI 1640 세포배양액에 넣어 제브라피쉬 배아에 도입하였다. 이를 위해 염색된 세포를 미세유리바늘에 주입하고 압축피코펌프 (Pneumatic PicoPump, WPI) 를 이용하여 제브라피쉬 배아에 50개 정도의 세포를 도입하였다. 이 때 사용되는 제브라피쉬는 수정 후 2일 [2 day post fertilization (dpf)] 차 상태이다. 암 세포 도입 24시간 후 [1 day post injection (dpi)]부터 황련 및 제프티닙을 24시간 간격으로 처리하면서 96시간 (4dpi)까지 CM-Dil로 염색된 암 세포를 공초점 현미경 (Zeiss LSM700, Carl Zeiss) 을 이용하여 관찰하였다. CM-Dil로 염색된 암 세포가 퍼진 범위를 Image J 소프트웨어로 (NIH, Bethesda, MD, USA)로 측정하여 황련이나 제프티닙의 약물을 처리하지 않은 군과 비교하여 분석하였다 (도 1).

1-10: 통계 분석

통계 분석은 독립 표본 t-test을 이용하여 수행하였다. 편차는 P < 0.05에서 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

실시예 2: 결과

2-1: 황련 추출물에 의한 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존력 및 이동성 억제

본 발명자들은 우선 폐암, EGFR-TKI-R 폐암 세포 및 정상 기관지 상피 세포의 생존력, 이동성과 침윤성에 대한 황련 추출물의 효과를 시험하였다. 세포의 생존력을 특정하기 위한 방법으로는 잘 알려진 MTT 분석을 이용하여 IC50(half maximal inhibitory concentration ) 값을 측정하였다. 정상 기관지 상피 세포에서는 100mg/ml의 농도에도 약 80%의 세포가 생존하는 반면 (IC50:178ug/ml 이상), 폐암 세포주 각각의 IC50 는 약 70 ug/ml, 30ug/ml, 70ug/ml 이였고, 이 폐암 세포주를 이용하여 구축된 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 IC50는 각각 약 33ug/ml, 20ug/ml, 33ug/ml 로 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존 억제능이 가장 효과적임을 확인하였다(도 2).

또한 황련 추출물이 암세포의 특징인 세포의 이동성 및 침윤성을 억제하는 효과가 있는지를 측정하기 위한 방법으로는 창상치유 (wound healing) 분석과 침윤성 분석을 이용하였다. 세포의 이동성은 황련 추출물의 농도 의존적 그리고 처리 시간 의존적으로 창상이 치유되는 속도가 느려짐을 통하여 세포의 이동성이 억제됨을 확인하였다(도 3a). 또한, 황련의 농도 의존적으로 EGFR-TKI-R 폐세포의 침윤성 역시 감소함을 확인하였다(도 3b). 이러한 결과는 황련 추출물이 폐암과 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존력, 이동성 및 침윤성을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.

2-2: 황련 추출물은 EGFR-TKI-R 폐암 세포주기 중 G2/M기를 정지 (arrest)시키며 세포사멸을 유도

본 발명자들은 황련 추출물이 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 사멸을 유도하는지 시험하였다. 세포주기 분석 결과, 황련 추출믈의 처리가 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 시간 의존적으로 subG1의 분획이 증가하였다(도 4a 및 도 4b). 광학현미경 하에서 황련추출물을 처리한 후 관찰한 결과, 황련 추출물을 처리하지 않은 세포에 비하여 황련 추출물을 처리한 세포가 죽어가는 것을 확인하였다(도 5a 및 5b). 이러한 결과를 면역세포화학 분석으로 확인한 결과, 황련 추출물은 말단 디옥시뉴클레오디딜 전이효소 dUTP 닉-말단 표지 (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling)-양성 세포의 수를 향상시킨 것으로 나타났다 (도 6). 이러한 결과는 황련 추출물이 적어도 부분적으로는 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.

2-3: 황련 추출물은 EGFR-TKI_R 폐암 세포에서 EGFR-AKT 신호전달계와 항세포사멸 단백질(antiapoptotic protein)인 Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xl 발현 억제하여 세포의 생존을 억제하고 세포사멸을 유도

황련 추출물에 의한 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 생존 억제와 세포사멸을 유도하는 근본적인 분자 기작을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 세포 생존과 세포사멸과 관련된 중요한 신호 분자들의 발현 패턴을 조사하였다. 먼저, 모 폐암세포(PC9, A549, HCC827)와 비교하여 EGFR-TKI_R 폐암 세포(PC9GR, A549GR, HCC827GRKU)에서 발현이 변화한 인자를 웨스턴 블럿으로 조사하였더니 EGFR 신호전달계의 하위 신호전달 인자인 AKT, AKT의 활성화 상태인 인산화된 pAKT와 항세포사멸분자인 bcl-2 family중 Mcl-1이나 Bcl-2의 발현이 증가한 것을 관찰 하였다(도 7). 황련 추출물을 EGFR-TKI-R 폐암 세포에 처리 하였더니 시간 및 농도 의존적으로 EGFR 및 AKT 신호전달계의 인자와 그 활성인자인 pEGFR과 pAKT의 발현을 억제하여 세포 생존을 억제하였고, EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 증가한 Mcl-1과 Bcl-2 뿐만이 아니라 bcl-xl의 발현을 억제하여 caspase 3와 PARP의 cleavage form을 증가시키면서 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다 (도 8).

2-4: 황련 추출물은 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 EGFR-TKI의 상호보완적으로(synergically) 민감도를 증가시킴

황련 추출물이 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존을 억제하고 특히 세포사멸을 유도하기 때문에, 폐암 세포가 저항성을 보이는 약물인 EGFR-TKI에 대한 민감도를 증가시킬 수 있는지 시험하였다. 본 발명자들은 황련 추출물과 EGFR-TKI를 선별된 농도에서 단일 혹은 조합하여 처리하여 세포의 생존능을 MTT 분석에 의하여 관찰한 결과, 조합하여 처리한 경우에 훨씬 더 세포의 생존능이 감소하는 것을 확인 하였다. 또한 이러한 생존능 저하가 EGFR/AKT 신호전달계인자와 항세포사멸인자의 Mcl-1, Bcl-2의 감소를 유도하는 것을 웨스턴 블럿으로 확인하였다(도 9). 이러한 약물의 조합이 상호 보완적인지(synergeical) 검증하기 위하여 Fa-CI Plot (Chu-Talalay Plot; www.combosyn.com) 중앙 효과(median effect) 분석을 시행하였다. 이러한 분석을 통하여 조합 인덱스 (combination index)를 산출한 결과 1보다 적은 것을 통하여 황련 추출물과 EGFR-TKI의 조합은 시너지 효과가 있음을 확인하였다 (도 10).

2-5: 황련 추출물 중 알킬레이팅 물질인 베르베린(berberin)의 항암효과

황련 추출물 중 유효성분으로 생각되는알킬에이팅 물질인 베르베린의 세포 생존 억제 효과를 MTT를 이용하여 분석한 결과 폐암 세포의 생존을 억제하는 것을 확인하였다(도 11). 특히 베르베린은 일반 폐암 세포주 뿐만 아니라 EGFR-TKI-R 폐암 세포주에서도 세포 생존 억제능이 뛰어남을 알 수 있다.

본 발명은 황련 추출물 및 베르베린이 폐암 세포 및 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 암세포 특이적으로 항암 효과를 보이는지 확인한 결과, 정상 기관지 상피 세포에서는 세포를 죽이는 효과가 매우 미비하지만, 폐암 및 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 특이적으로 EGFR/AKT 신호전달계의 활성을 억제하여 세포생존을 억제하고 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xL의 발현을 억제하여 세포사멸 경로를 유도하는 것을 확인하였다. 또한, EGFR-TKI와 황련 추출물을 동시에 처리하였을 경우 상호 보완 시너지)효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 황련 추출물은 폐암 및 EGFR-TKI-R 폐암세포에서 EGFR-TKI의 민감성 증진을 위하여 EGFR-TKI 와 병행하여 사용될 수 있다.

본 발명자들은 황련 추출물이 EGFR-TKI-R 폐암 세포 특이적으로 항암 효과가 있는지와 기존에 사용하고 있는 EGFR-TKI와 동시 사용시 EGFR-TKI의 효과를 증진시킬 수 있는지를 조사하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명자들은 황련 추출물이 정상 기관지 상피세포의 생존에는 거의 영향을 미치지 않고 폐암과 EGFR-TKI-R 폐암 세포 특이적으로 세포생존을 억제하고 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타내며, EGFR-TKI와 동시에 사용하였을 경우 EGFR-TKI의 효능을 증진시키는 것을 확인하였다.

2-6: in vivo 제브라피쉬 제노그라프는 모델에서 황련 추출물의 항암효과

황련 추출물이 in vitro 세포주 모델 뿐만 아니라, in vivo 모델에서도 EGFR-TKI-R 폐암세포에 항암효과를 나타내는지 시험하였다. 본 발명자들은 황련 추출물 또는 제프티닙을 선별된 농도에서 EGFR-TKI-R 세포가 이식된 제브라피쉬에 처리하여 제브라피쉬 개체의 생존력과 이식된 암세포의 분포를 관찰하였다. 그 결과, 암세포의 분포도는 제프티닙 뿐만 아니라 황련 추출물 역시 유의하게 암세포의 분포를 저해하는 것을 확인하였다 (도 12a). 하지만, 약물 처리가 되지 않은 비교군에 비하여 제프티닙을 처리한 군은 개체의 생존률이 감소한 것에 비하여 황련 추출물을 처리한 군은 개체의 생존률이 감소하지 않았다 (도 12b). 상기 결과에 따라 황련 추출물이 제프티닙에 비하여 세포에 독성이 적어 약물부작용을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다..

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어서는 안될 것이다.