POLYETHYLENE GLYCOL-B-POLYTYROSINE-LIPOIC ACID COPOLYMER, POLYPEPTIDE MICELLE, METHOD FOR PREPARATION THEREOF, AND APPLICATION THEREOF

下面结合附图以及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一 PEG-PTyr-LA聚多肽共聚物的合成

首先，PEG- b-PTyr是以PEG-NH₂作为大分子引发剂开环聚合Tyr-NCA单体得到的。具体如下，将Tyr-NCA（231.0 mg，1115.7μmol）溶解于2 mL DMF中，在氮气环境下，慢慢滴加至溶有PEG-NH₂（5 KDa ，400.0 mg，80.0μmol）的DMF（4 mL）溶液中，置于40 ℃ 油浴中反应。72小时后，用过量的冰乙醚沉淀，离心后用氯仿溶解，之后重复沉淀两次。收集沉淀置于真空干燥箱中干燥24 h得到白色粉末状聚合物PEG- b-PTyr（ M_n：7.0 kg/mol）。

PEG- b-PTyr-LA是在DMAP催化下通过PEG- b-PTyr侧链上酚羟基经酯化反应得到的。具体操作如下：硫辛酸（LA，108.5 mg，526.7μmol）于氮气环境下溶解于3 mL DCM中，加入二环己基碳二亚胺（DCC，51.9 mg，251.9μmol）于30 ℃油浴中避光反应。24小时后过滤掉不溶物二环己基脲（DCU），得到LAA的DCM溶液，将其滴加至溶有的PEG- b-PTyr（320 mg，45.7μmol）和DMAP（6.5 mg，53.3μmol）的DMF溶液中避光反应。24小时后用过量的冰乙醚沉淀，离心沉淀后并用三氯甲烷溶解，如此重复沉淀两次。最后，将所得的淡黄色聚合物于真空干燥箱中干燥12 h，得到PEG- b-PTyr-LA，产率：80.7%。

PEG- b-PTyr-LA核磁表征见附图1， ¹H NMR （400 MH_Z, DMSO- d₆） 9.07 (1 H, -C₆H₄-OH), 7.95 (1 H, -HNCH(CH₂)CO-), 7.17, 6.96, 6.59 (4 H, -C₆H₄-), 4.42 (1 H, -HNCH(CH₂)CO-), 3.51 (4 H, -CH₂CH₂O-; -S-S-CH-), 3.16 (2 H, -HNCH(CH₂)CO-; 2 H, -S-S-CH₂-), 2.41-1.44 (10 H, LA)。 M_n （核磁）=8KDa， M_w/ M_n=1.06，PTyr的分子量2 KDa。

上述制备方案可表示如下：

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实施例二 cRGD-PEG-PTyr的合成

在氮气环境下，向溶解有allyl-PEG- b-PTyr（200 mg，28.6μmol，制备方法参见实施例一，将PEG-NH₂（400.0 mg，80.0μmol）更换为allyl-PEG-NH₂（ M_n=5.0 K，400.0 mg，80.0μmol）的DMF溶液中分别加入巯基修饰的cRGD-SH（33.9 mg，57.1μmol）和光敏剂2959（4.0 mg，17.8μmol），将混合溶液于冰浴条件下置于紫外固化箱中反应15 min。反应液利用大量DMF透析（Specture/Pore，MWCO 3500），除去过量的cRGD和2959。最后，聚合物在过量的无水乙醚中沉淀，沉淀物于真空干燥箱干燥12小时，产率：70.5%。

上述制备方案可表示如下：

cRGD-PEG-PTyr核磁表征见附图2，¹H NMR （400 MH_Z, DMSO- d₆） 9.07 (1 H, -C₆H₄-OH), 7.95 (1 H, -HNCH(CH₂)CO-), 6.91, 6.54 (4 H, -C₆H₄-OH), 4.38 (1 H, -HNCH(CH₂)CO-), 3.50 (4 H, -CH₂-CH₂-O-), 2.75 (2 H, -HNCH(CH₂)CO-)。在¹H NMR上δ7.1-7.2 ppm处出现cRGDfk中苯丙氨酸苯环的特征峰。通过9,10-菲醌法测得cRGDfk的接枝率为92.7%； M_n （核磁）=7.6 KDa， M_w/ M_n=1.06。

实施例三 cRGD-rPTM-Dox聚合物胶束的制备

cRGD修饰的聚酪氨酸胶束是通过透析法制备的，将摩尔比为2:8的cRGD-PEG-PTyr/PEG- b-PTyr-LA和设计载药量为20%的阿霉素Dox溶解在DMF中；然后将100μL（10 mg/mL）的聚合物/药物溶液逐滴加到1 mL pH 7.4的HEPES缓冲溶液中，边滴加边以400 rpm的速度搅拌。搅拌完毕后将胶束/药物溶液转移在截留分子量为3.5 K的透析袋中以pH 7.4的HEPES缓冲溶液为介质透析8 h，每2 h换一次透析介质；透析结束后向胶束/药物溶液中加入25 μL（1 mg/mL）的DTT溶液，并置于37︒C 100 rpm的摇床中交联12 h即得交联载药胶束cRGD-rPTM-Dox，即纳米药物；同样的方法，不添加设计载药量为20%的阿霉素Dox，得到交联空胶束，记为cRGD-rPTM；同样的方法，不添加cRGD-PEG-PTyr，得到交联载药胶束，记为rPTM-Dox；表征分别见表1，胶束的粒径分布及透射电子显微镜图参见图3A，粒径及粒径分布随载药量的变化参见图3B。

表1 包载阿霉素的聚多肽胶束的表征

^a通过荧光分光光度计测定； ^b通过动态光散射仪测定 （1 mg/mL, 25 ºC）； ^c在标准毛细管样品池中测定（1 mg/mL, 25 ºC）。

实施例四 载药聚合物胶束体外释放

PEG- b-PTyr-LA的疏水链段小，交联后该胶束即使稀释100倍粒径依然保持不变。由于二硫键会在还原环境下发生断裂，所以交联后的胶束在10 mM GSH的HEPES溶液中经过1 h粒径就开始变大，粒径分布也变宽。而在pH 7.4的HEPES缓冲溶液或是10%FBS中该胶束即使放置24 h其粒径和粒径分布均未发生变化（图3C）。该载药胶束在还原环境下可以快速释放包载的Dox，在GSH存在的条件下交联胶束48 h释放了80%的Dox，而在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中交联胶束仅仅释放了18%左右（图3D）。聚合物疏水链段小，在不交联的情况下稳定性差，无法作为药物载体；在以后的实验中，选取DLC（实测值）为18.5 wt.%的载药胶束进行细胞实验和动物实验。

实施例五MTT法测试聚合物胶束的细胞毒性和细胞流式观察细胞内吞情况

将MDA-MB-231细胞以3×10³/孔的密度铺于96孔板中孵育12 h使细胞贴壁并且覆盖率达到80%左右。然后每孔加入20 μL不同Dox浓度的cRGD-rPTM-Dox使96孔板中Dox的浓度为0.01、0.1、0.25、0.5、1、2.5、10、20μg/mL。细胞与药物一起孵育30分钟后吸走培养基继续孵育71.5 h。孵育结束后向每孔中加入10μL MTT的PBS溶液（5 mg/mL）孵育4 h后吸走培养基，然后加入150μL DMSO溶解产生的甲瓒。充分溶解甲瓒后在酶标仪上测试492 nm波长下的吸光度值。空白胶束的毒性用同样的方法测定。

通过细胞流式实验验证了靶向胶束的靶向性。MDA-MB-231细胞以2×10⁵个/孔的密度铺在6孔板上，铺板结束后将细胞置于二氧化碳培养箱培养12 h。之后每孔加入200 μL的cRGD-rPTM-Dox或rPTM-Dox（Dox浓度20 μg/mL），细胞与胶束一起孵育30 min。孵育结束后用胰酶将细胞消化下来，离心收集细胞并用PBS分散再离心，PBS分散离心两次后将收集的细胞用500 μL PBS分散均匀后送细胞流式仪检测。

图4是实施例五中cRGD-rPTM空胶束对MDA-MB-231细胞的细胞毒性（A）； 载药胶束（rPTM-Dox 和cRGD-rPTM-Dox）对MDA-MB-231细胞的毒性（B）；细胞流式分析用Lipo-Dox、rPTM-Dox和cRGD-rPTM-Dox处理后的 MDA-MB-231细胞（C）；从结果可以看出，空胶束对MDA-MB-231细胞几乎没有毒性，而载药后该胶束可以显著杀伤MDA-MB-231细胞。细胞流式试验表明，在胶束比表面修饰短肽cRGD后该胶束可以有效的靶向到 α_vβ₃过表达的MDA-MB-231细胞，经靶向胶束孵育后MDA-MB-231细胞内的荧光强度为非靶向组处理的2.3 倍。

实施例六载药胶束的药代动力学、生物分布和肿瘤穿透

本发明中所有的动物操作均符合苏州大学动物实验中心和苏州大学动物保护和使用委员会的批准规定。

在cRGD-rPTM-Dox的药代动力学实验中，5周龄的Balb/c白鼠尾静脉注射剂量为10 mg/kg 的cRGD-rPTM-Dox、rPTM-Dox、cRGD-PTM-Dox。之后在既定的时间点眼眶取血50 μL，取出的血液经过离心后收集15 μL的上层血清并用GSH浓度为20 mM的DMSO溶解血清并测试荧光强度，最后通过工作曲线得出每个时间点血清中Dox的浓度，时间对浓度作图后拟合得出半衰期。

生物分布实验同样用MDA-MB-231细胞接种的裸鼠，待肿瘤长至150 mm³后通过尾静脉注射剂量为10 mg/kg 的cRGD-rPTM-Dox、rPTM-Dox，6 h后解剖小鼠取出主要脏器，将脏器中的血液清洗干净后在小动物成像仪上观察Dox在各个脏器中的分布情况。成像结束后将小鼠的脏器称重，并且加入0.5 mL 溶解有吐温80的PBS，肝脏加入1 mL 溶解有吐温80的PBS，然后将各个脏器置于匀浆机上研磨匀浆。匀浆结束后加入GSH浓度为20 mM的DMSO溶液过夜，之后离心取上层清液在荧光仪上测量荧光强度并根据工作曲线计算出各个脏器中Dox的含量。

肿瘤穿透实验同样使用皮下接种的小鼠，待肿瘤长至150 mm³后尾静脉注射cRGD-rPTM-Cy5。经过2个小时和6个小时后剥离肿瘤用福尔马林浸泡24 h送切片。之后采用免疫荧光染色观察Cy5标记的胶束在肿瘤部位的富集情况。

图5是实施例六中cRGD-rPTM-Dox、rPTM-Dox和cRGD-PTM-Dox的药代动力学结果图（A）；cRGD-rPTM-Dox、rPTM-Dox的生物分布（B）；药代动力学结果可以说明相比于未交联胶束（t_1/2=2.24 h），交联胶束（t_1/2=3.57 h）可以提高化疗药物阿霉素的血液循环时间。生物分布试验进一步表明修饰了cRGD短肽的胶束在肿瘤部位输送的药物量是非靶向胶束的1.6倍，增加胶束对肿瘤的靶向性。

实施例七 载药胶束对荷MDA-MB-231皮下瘤小鼠的体内治疗实验

用MDA-MB-231的皮下肿瘤模型来研究cRGD-rPTM-Dox的体内抗肿瘤效果。该实验共有4组分别为cRGD-rPTM-Dox组、rPTM-Dox组、Lipo-Dox组和PBS组，每组6只老鼠。在肿瘤长至100 mm³时开始给药每隔4天给药一次，共给药4次，Dox给药剂量除了Lipo-Dox组为4 mg/kg外另外两组均为6 mg/kg。在治疗过程中每两天对各组小鼠进行称重并用游标卡尺测量肿瘤的长度（L）和宽度（W），肿瘤体积的测量公式为：V=L×W×W÷2。

治疗结束并经过两个治疗周期后取出每组中的一只老鼠解剖取出主要脏器和肿瘤。将取出的组织中的血液清洗干净后置于福尔马林中浸泡24 h，浸泡结束后用石蜡进行包埋切片，再用苏木精和伊红进行染色。然后在光学显微镜下观察主要脏器及肿瘤的情况。

图6是实施例七中纳米胶束药物（Lipo-Dox、rPTM-Dox和cRGD-rPTM-Dox）对MDA-MB-231乳腺癌移植瘤的体内抗肿瘤效果：（A）肿瘤体积生长曲线，（B）为小鼠抑瘤率及肿瘤质量的结果，（C）为体重变化。在治疗实验中，接受靶向胶束治疗后，荷瘤小鼠的肿瘤体积减小（里葆多治疗的小鼠肿瘤体积是靶向胶束组的2.6倍，非靶向胶束组为4.5倍，PBS组为8.5倍），抑瘤率较高为83%。并且在治疗过程中小鼠的体重没有显著降低，说明该胶束对小鼠的毒性小。