LEUCONOSTOC CITREUM WITH STARCH AGGLUTINATION ACTIVITY

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有淀粉凝集活性的柠檬明串珠菌。

利用酸浆分离淀粉在我国有上百年的历史，酸浆法获得的淀粉溶出较少、韧性好，生产出的粉丝更加透亮，适合粉丝加工。虽然酸浆工艺历史悠久，但酸浆沉淀淀粉的机制一直是谜。

1959年轻工业部科学研究设计院科研人员研究认为，酸浆的主要作用是增加淀粉浆的酸度，其浑浊成分对淀粉有凝聚作用；1974年北京大学和北京粉丝厂的酸浆研究小组，对绿豆酸浆沉淀淀粉机制进行了首次解析，发现酸浆中对淀粉具有凝集作用的主要是活性菌体。他们共分离到80余株菌株，只有13株对淀粉有沉淀作用，经鉴定均为乳酸链球菌。他们在酸浆中还分离到其他种属的乳酸菌，对淀粉均没有凝聚作用，同时还发现非酸浆来源的乳酸链球菌对淀粉也没有凝聚作用，说明酸浆来源的乳酸链球菌具有其独特的遗传特性。1987年山东省生物研究所魏凤鸣等人从龙口粉丝酸浆中也分离出对淀粉有沉淀作用的乳酸链球菌。1997年贵州农学院江萍等从自制酸浆中分离到对淀粉有沉淀作用的乳酸链球菌，首次在实验室中将酸浆用于马铃薯淀粉沉淀。1999年河北农业技师职业示范学院杜连起等从自制甘薯酸浆中分离到一株乳酸链球菌和一株野生酵母菌，两种菌混合使用促淀粉沉淀效果最佳。以上有关酸浆中淀粉凝聚菌株的分离采用多是绿豆酸浆，分离的具有淀粉凝聚功能的皆为乳酸链球菌，非酸浆来源的乳酸链球菌并没有此功能。2009年沈阳农业大学李新华组的张莉力等从甘薯酸浆中分离到一株副干酪乳杆菌对淀粉具有絮凝活性，其活性也与菌体表面蛋白成分相关。到目前为止，人们从各类酸浆中分离的具有淀粉沉淀活性的微生物菌种只有以上所述两种乳酸菌。

酸浆沉淀淀粉的品质好，但酸浆培养主要依赖人工经验，过程稳定性没有保障。相关研究表明酸浆沉淀的本质是具有淀粉凝集作用的乳酸菌等菌体对淀粉的凝集作用，因此，有必要进一步筛选具有高淀粉凝集活性的优良菌株，丰富具有淀粉凝集作用的微生物资源库，为提高传统淀粉加工技术水平、生产效率等奠定 基础。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株具有淀粉凝集活性的柠檬明串珠菌及其应用，经试验验证，本申请分离筛选得到的柠檬明串珠菌具有优异的淀粉凝聚沉淀性能，将其应用于酸浆沉淀淀粉中，既可以保留酸浆工艺的快速沉淀的优点，又能克服自然发酵酸浆稳定性差的缺陷，因此极具大规模工业化生产及实际应用之价值。

为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)SFL-2-8，该菌株从甘薯淀粉沉淀池中分离筛选到的，通过16S rDNA序列测定初步鉴定为柠檬明串珠菌，命名为SFL-2-8(Leuconostoc citreum SFL-2-8)，该菌株已于2018年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO:M 2018631。

所述菌株SFL-2-8在MRS培养基平板上25-28℃培养培养24小时菌落直径约1-1.5mm，菌落乳白色、圆形，凸起、有光泽。在MRS液体培养基中，25-28℃静置培养培养12-16小时，细胞呈短杆状，进椭圆形，呈单个或短链存在，革兰氏染色阳性；通过GenBank数据库中进行对比，菌株SFL-2-816S rDNA序列与GenBank数据库中的记载的柠檬明串珠珠菌16S rDNA序列相似性达到99-100％。

所述菌株SFL-2-8接种于乳酸菌培养常用MRS培养基或其他有利于菌体生长的培养基中，25-28℃采用三角瓶静置培养或发酵罐微耗氧培养12-24小时，将菌体培养液或经分离的菌体添加至新鲜淀粉浆中，可使淀粉颗粒凝聚，加速淀粉沉淀速度，沉淀周期比自然沉淀缩短80％-90％。所述淀粉浆包括但不限于甘薯淀粉、马铃薯淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉。

本发明的有益效果：

本发明首次分离得到一株具有淀粉凝集沉淀活性的柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)SFL-2-8，经试验验证，该菌株培养液或经分离后的菌体对甘薯淀粉、马铃薯淀粉等多种淀粉浆都具有促淀粉凝聚并加速沉淀分离的作用，极具工业化应用价值。

图1为菌株SFL-2-8的菌落形态图；

图2为菌株SFL-2-8菌体形态图(×1600)；

图3为菌株SFL-2-8系统发育树。

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

其中，实施例中使用的培养基组分如下：

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，柠檬酸氢二铵2，葡萄20，吐温80 1，乙酸5，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，pH 6.2-6.6。

菌种筛选培养基：以新鲜甘薯汁为基质添加2％葡萄糖，0.5％玉米浆，0.3％碳酸钙，琼脂2％，pH自然，118℃，高压蒸汽灭菌20min，倾倒平板。

生鲜甘薯汁：新鲜甘薯切块，加1.5-3倍的水，组织捣碎机或胶体磨打碎以后，采用120-200目滤布过滤除去甘薯渣，然后1000-3000离心1-5分钟分离淀粉，收集离心上清即为生鲜甘薯汁。规模生产直接取用离心轻相即可。可以通过甘薯破碎时的加水比调整其可溶性固形物含量2％左右。

实施例中淀粉质量指标的测定参照相关淀粉标准进行。

实施例1具淀粉凝聚作用菌株的分离筛选

从泗水某甘薯淀粉加工企业淀粉沉淀池中取样，经适当稀释涂布筛选培养基 平板，共挑取50支菌株，经初步显微镜观察其中酵母菌10株，细菌30株。然后接种MRS培养基28-30℃静置培养24小时，取培养液作为沉淀剂进行淀粉沉淀实验，并用培养基做空白对照，结果见表1。结果显示共有13株细菌培养液对淀粉有凝聚效果，其中6株效果显著。然后对这6株菌的16sRNA序列进行了测定，与GenBank数据库进行比对，菌株J-1、J-15、J-21、J-26、初步鉴定为为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，2-8、3-2初步鉴定为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)。

表1具有淀粉凝聚效果的菌株筛选

将上述6株菌按照一株接三瓶接种MRS液体培养基中，25-28℃静置培养24小时，测定培养液的pH及菌体浓度(OD值)。然后进行淀粉凝聚实验：分别取不同量菌体培养液加入到甘薯淀粉浆中，充分混匀后静置，观察和计量淀粉颗粒出现凝集的时间，结果见表2。通过实验可以发现，在添加量均为10％(v/v)的情况下淀粉出现絮凝沉淀的速度差距不明显，30s内淀粉均出现沉淀现象，当加量为5％时J-26和2-8两株菌表现出了明显的优势。选择菌株2-8作为目标菌株进行进一步研究。

表2菌株复筛结果

实施例2菌株的形态学及16S rDNA的鉴定

1.菌落形态：菌株2-8在MRS培养基上28℃，培养24小时，菌落形态如图1所示：菌落圆形，表面凸起、直径约1-1.5mm，呈灰白色，表面光滑有光泽、边缘整齐。

2.菌体形态：用结晶紫对菌体进行单染色，菌株2-8菌体为短杆菌，近似椭圆形，以成对或短链形式存在(见图2)。

3.16S rDNA的鉴定：对菌株2-8的16s rDNA序列(见SEQ ID No.1)进行测序，并构建了系统发育树(见图3)。

结合菌体形态特征和16s rDNA序列比对，菌株2-8初步鉴定为柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)。柠檬明串珠菌未见淀粉沉淀报道，且淀粉凝聚沉淀效果最好，故选择菌株2-8为目标菌株进行进一步研究。

实施例3菌株2-8沉淀淀粉性能研究

文献报道酸浆沉淀淀粉主要是菌体对淀粉的凝聚作用。为了确定菌株2-8沉淀淀粉机制，我们对2-8菌株培养液以及离心后的上清液和菌体悬液(培养液离心(3000rpm，5min)去上清，菌体用无离子水洗涤后，用水恢复到原体积)进行淀粉凝聚实验。结果显示(表3)采用洗涤后菌体进行沉淀实验，加量与用培养液直接进行沉淀实验几乎相同，而去菌体培养液无淀粉凝聚现象，因此可以判断菌株2-8可以凝聚淀粉的主要作用因素也是微生物菌体。

表3菌株2-8培养液淀粉沉淀结果

然后本研究对培养液和菌体又进行加热和冷冻处理，结果显示(表4)菌体加热后几乎全部丧失了淀粉凝聚的能力，离心菌体在4℃保存淀粉凝聚能力基本 没有变化，但如果将离心菌体-20℃冷冻，其淀粉凝聚能力显著下降，据此可以推断菌体需要处于生物活性状态才具有淀粉凝聚的能力。

表4冷热处理对菌株2-8沉淀淀粉活性的影响

实施例4菌体浓度与淀粉沉淀速度的关系

实验进一步考察了菌体浓度对淀粉沉淀速度的关系。用MRS培养基培养2-8菌株结束后，离心收集菌体，用去离子水稀释菌体至不同的浓度作为沉淀剂，然后进行淀粉沉淀试验。将不同浓度的菌悬液加入到甘薯淀粉浆中，添加量足以使淀粉凝聚沉淀，实验结果见表5。从结果可以看出，菌体浓度越高，所需沉淀剂越少。另外，研究还将不同浓度的沉淀剂按相同比例加入淀粉浆中，观察淀粉出现凝聚的时间，结果见表6。实验发现如果沉淀剂菌体浓度太低，淀粉不会出现凝聚显现，沉淀剂达到一定量后淀粉会快速凝聚。

表5不同的菌体浓度致淀粉凝聚所需添加量

表6菌体浓度与淀粉凝聚的关系

实施例5淀粉浆浓度与淀粉沉淀速度的关系

通过浓缩或稀释调整实验淀粉浆浓度，然后加入相同比例的沉淀剂，充分混匀、静置进行淀粉沉淀，结果见表7。结果显示在实验范围内淀粉凝聚效果与淀粉浆中淀粉浓度并不显著相关。另外研究还比较了不同淀粉浆液浓度淀粉凝聚沉淀后上层清液淀粉残留量，结果显示(表7)在实验范围内淀粉残留基本没有差异。

表7不同淀粉浆浓度沉淀后淀粉残留

*淀粉沉淀后取上清离心测定清液中淀粉含量。

实施例6淀粉收率及质量

取2L新鲜甘薯淀粉浆4份，其中两份加入5％的菌株2-8培养液(OD0.468)进行淀粉沉淀实验，2份加入5％去菌体培养液，2份加5％的水，充分混合，静置沉淀。待沉淀完全后，分离上清，离心测定淀粉残留率。沉淀淀粉加约2倍水洗涤、沉淀，分离上清，沉淀淀粉再加水洗涤一次，脱水后55℃烘干。然后分析各样品淀粉含量、水分、蛋白含量、白度、粘度，结果见表8。

表8菌株2-8对淀粉收率及质量的影响

从表中数据可知，通过2-8菌体絮凝沉淀得到的淀粉，在收率及相关理化指 标等方面与对照组相比无明显差异，因此从淀粉收率及淀粉质量角度考虑，采用菌体进行淀粉加速沉淀工艺可行。

实施例7菌株2-8淀粉沉淀剂的应用拓展

制备甘薯、马铃薯、绿豆等淀粉溶液，然后用菌株2-8菌悬液作为沉淀剂进行淀粉沉淀试验，观察沉淀剂对各种淀粉浆中淀粉的凝聚效果。

表9菌株2-8淀粉沉淀剂对不同淀粉浆的沉淀效果

淀粉沉淀试验结果表明(表9)，菌株2-8菌悬液可以沉淀以上所有的淀粉浆中的沉淀，浆液中淀粉残留与自然沉淀没有显著区别。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。