PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR USE PREVENTING AND CURING RESPIRATORY DISEASES IN WINTER

本发明属于中医药领域，涉及一种用于冬季预防或治疗呼吸道疾病的中药组合物及其制剂，尤其茶剂。本发明还涉及所述药物组合物的使用方法和制药用途。

冬季是呼吸道疾病多发季节，咽炎是呼吸道疾病的常见病症之一。咽炎具有反复发作、症状顽固和病程迁延等特点，这将给患者的日常生活、学习和工作带来较大不良影响，给患者的身心健康造成较大的创伤。临床中咽炎的治疗以抗病毒药物和抗菌药物的使用为主，但有时不能达到令人满意的治疗效果，且还会存在一些较为严重的副作用。对于咽炎的治疗，我国传统中医药更注重从疾病的整体出发，强调辩证治疗，治疗效果往往更令人满意，同时副作用较少。但是，目前临床中应用的中药制剂相对有限，未见报道冬季用于预防或治疗咽炎的使用便利和效果显著的中药制剂。

药茶，即茶剂，系指饮片或提取物与茶叶或其他辅料混合制成的内服制剂，可分为块状茶剂、袋装茶剂和煎煮茶剂，为中医药宝库的重要成员。袋装茶剂系指茶叶、饮片粗粉或部分饮片粗粉吸收提取液经干燥后，装入袋的茶剂，其中装人饮用茶袋的又称袋泡茶剂。袋泡茶剂药量大、体积小、方便服用、溶出快，最大限度的保留了传统汤剂的优势与特色，更接近大众的生活习惯，日益发展成为大众喜爱的中药剂型之一。在冬季，服用中药茶剂可以达到早干预早预防的有益效果。

因此，对冬季预防或治疗咽炎等呼吸道疾病、提高患者的生活质量提高和/或防止咽炎病情复发的手段仍然存在未满足的需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药组合物和中药制剂。

本发明的另一个目的是提供中草药在制备用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药组合物或中药制剂中的用途。

本发明的再一个目的是提供一种在冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的方法，该方法包括给予有需要的受试者有效量的中药组合物或中药制剂。

本发明人经过深入研究和创造性劳动，得到了一种药物组合物。本发明人惊奇地 发现，该药物组合物养阴利咽，具有益气润肺、清喉利咽、去秽化浊等功效，能够有效地治疗和/或预防咽炎等冬季呼吸道疾病；能够有效地祛痰和/或止咳。在此基础上，本发明人完成了本发明。

可以从不同方面描述本发明，这些方面及其任何形式中所描述的发明相互独立又彼此关联，相互结合构成本发明的内容。

一方面，本发明提供一种用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药组合物、中药制剂或袋泡茶剂。

本发明的中药组合物由药用形式的如下中药材组成或制成：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶。

本发明的中药组合物可以由如下中药材饮片粉末的混合物或中药材饮片混合物的粉末组成：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶。

本发明的中药组合物也可以由如下中药材各自的配方颗粒组成：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶。

本发明的中药组合物还可以由如下中药材饮片的提取物组成：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶。

本发明的中药制剂包含本发明的中药组合物，且还可以包含药剂学上可接受的辅料。换言之，本发明的中药制剂包含药用形式的如下中药材或其提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药制剂可以被配制成口服液或汤剂，其包含如下中药材的水提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药制剂可以被配制成袋泡茶剂，其包含如下中药材饮片的粉末：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及 非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料，或食品或饮料中可接受的添加剂。

本发明的中药制剂可以被配制成颗粒剂，其包含如下中药材饮片的提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药制剂可以被配制成丸剂，其包含如下中药材饮片的提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药制剂可以被配制成胶囊剂，其包含如下中药材饮片的粉末或其提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药制剂可以被配制成糖浆剂，其包含如下中药材饮片的提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药制剂可以被配制成膏剂，其包含如下中药材饮片的提取物：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料。

本发明的袋泡茶剂包含如下中药材饮片的粉末：

牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖和甘草以及非必需的发酵茶；

以及药剂学上可接受的辅料，或食品或饮料中可接受的添加剂。

另一方面，本发明提供中草药在制备用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药组合物、中药制剂或袋泡茶剂中的用途，所述的预防和/或治疗呼吸道疾病包括(1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊；(2)治疗和/或预防咽炎；(3)祛痰；以及(4)止咳中的一项、多项或全部，其中所述的中药组合物、中药制剂或袋泡茶剂具有如上 所定义的组成。

再一方面，本发明还提供一种在冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的方法，该方法包括给予有需要的受试者有效量的本发明的中药组合物、中药制剂或袋泡茶剂，所述的预防和/或治疗呼吸道疾病包括(1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊；(2)治疗和/或预防咽炎；(3)祛痰；以及(4)止咳中的一项、多项或全部，其中所述的中药组合物、中药制剂或袋泡茶剂具有如上所定义的组成。

使用本发明的中药组合物、中药制剂或袋泡茶剂可以产生如下(1)-(5)项中一项、多项或全部所述的技术效果：

(1)养阴利咽；

(2)益气润肺、清喉利咽、去秽化浊；

(3)有效地治疗和/或预防咽炎；

(4)有效地祛痰；以及

(5)有效地止咳。

附图简要说明

图1A：赤芍的薄层鉴别结果。①芍药苷对照品，②本发明药物组合物，③本发明药物组合物赤芍阴性。

图1B：射干的薄层鉴别结果。①次野鸢尾黄素对照品，②射干对照药材，③本发明药物组合物，④本发明药物组合物射干阴性。

图1C：虎杖薄层鉴别图谱。①虎杖苷对照品，②本发明药物组合物。

图2A-图2D：急性咽炎大鼠咽部组织病理切片(HE×10)。其中，图2A.空白组；图2B.模型组；图2C.阿莫西林组；图2D.本发明药物组合物组。

图3：本发明药物组合物样品对急性咽炎大鼠外周血中TNF-α含量的影响。与正常组比较,^**P<0.01；与模型组比较,^**P<0.01。

图4：本发明药物组合物样品对急性咽炎大鼠外周血中IL-1β含量的影响。与正常组比较,^**P<0.01；与模型组比较,^*P<0.05。

图5：本发明药物组合物样品对急性咽炎大鼠外周血中IL-6含量的影响。

图6A：CCK-8法检测不同浓度本发明药物组合物样品处理后THP-1细胞活力值 (n＝6)。**P<0.01vs对照*P<0.001vs对照。

图6B：LDH法检测不同浓度本发明药物组合物样品处理后THP-1细胞活力值 (n＝6)。**P<0.01vs对照*P<0.001vs对照。

图7A：本发明药物组合物样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子TNF-α的表达 (n＝3)**P<0.01vs对照##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。

图7B：本发明药物组合物样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IP-10的表达 (n＝3)**P<0.01vs对照##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。

图7C：本发明药物组合物样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IKBα的表达 (n＝3)**P<0.01vs对照##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。

图7D：本发明药物组合物样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IL-6的表达 (n＝3)**P<0.01vs对照##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。

图7E：本发明药物组合物样品抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IL-1β的表达 (n＝3)**P<0.01vs对照##P<0.01vs LPS#P<0.001vs LPS。

图8A：CCK-8法检测本发明药物组合物样品对293T细胞活力的影响 (n＝18)。^**P<0.01vs对照^*P<0.001vs对照。

图8B：LDH法检测本发明药物组合物样品对293T细胞活力的影响 (n＝18)。^**P<0.01vs对照*P<0.001vs对照。

图9A：不同浓度本发明药物组合物样品对293T细胞ARE荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)。注：**P<0.001vs对照*P<0.05vs对照。

图9B：不同浓度本发明药物组合物样品对293T细胞NF-κB启动子荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)。注：**P<0.01vs对照,*P<0.05vs对照,##P<0.01vs模型,#P<0.05vs模型。

实施本发明的方式

上文已从一般方面概述了本发明，下面将结合实施例进一步详细描述本发明。

为准确理解本发明中所使用的术语，下面特别定义部分术语的含义。对于在此没有特别定义的术语，它们具有本领域技术人员普遍理解和接受的含义。如果在此所定义的某个术语的含义与本领域技术人员普遍理解和接受的含义不一致，则该术语的含义以在此所定义的含义为准。

本发明中使用的术语“牛蒡子”是指菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实。

本发明中使用的术语“射干”是指鸢尾科植物射干Belamcanda chinensis(L.)DC.的干燥根茎。

本发明中使用的术语“桔梗”是指桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)

A.DC.的干燥根。

本发明中使用的术语“赤芍”是指毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根。

本发明中使用的术语“紫苏叶”是指唇形科植物紫苏Perilla frutescens(L.)Britt.的干燥叶(或带嫩枝)。

本发明中使用的术语“金银花”是指忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。

本发明中使用的术语“焦山楂”是指按照中国药典记载的清炒法(通则0213)炮制山楂得到的表面焦褐色、内部黄褐色的山楂制品。“山楂”是指蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实。

本发明中使用的术语“黄芪”是指豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。

本发明中使用的术语“虎杖”是指蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根。

本发明中使用的术语“甘草”是指豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。

本发明中使用的术语“发酵茶”是指茶叶经发酵得到的茶制品，例如红茶，黑茶和乌龙茶，所述的“茶叶”是指Camellia sinensis的叶。

本发明中使用的术语“中药材饮片的粉末”是指采用物理方法，例如粗粉碎、细粉碎、微粉化和物理破壁粉碎等方法将中药材饮片加工成的全成分无添加的中药材粉末。

本发明中使用的术语“配方颗粒”是指采用现代科学技术，仿照传统中药汤剂煎煮的方式，将中药饮片经浸提，浓缩，干燥等工艺精制而成的单味中药产品。产品保持了中药饮片的性味与功效，质量稳定可靠，应用于中医临诊处方的调配，适应辨证施治，处方变化的需要，且有不需煎煮，服用方便的优点。

本发明中使用的术语“提取物”是指用合适的可药用溶剂例如水或醇水溶液提取任何形式的所述中药材(包括中药材饮片、中药材粉末，例如中药材微粉化粉末)得到的物质，包括特定的有效成分和包含有效成分的混合物，该物质适用于重大疾病例如新冠肺炎恢复期患者康复，有效预防、治疗或缓解感染性疾病后遗症或并发症或促进 受损由感染性疾病引起的组织、器官或系统的功能恢复。提取物的形式包括但不限于固体、半固体、溶液、混悬液、浓缩液、膏状体和粉末。适用于本发明中提取中药材以得到提取物的水包括可用于制备中药活性提取物的各种水，例如药用水，例如蒸馏水和去离子水等。

本发明中使用的术语“醇水溶液”是指适合浓度(例如低浓度，特别是10-50％v/v)的含醇水溶液，适用的醇包括各种醇，优选乙醇。在一定条件下，也可以使用浓度高于50％v/v的含醇水溶液。

本发明中使用的术语“患者”与“受试者”可以相互代替使用，是指患有呼吸道疾病例如上呼吸道疾病例如咽炎、喉炎或咽喉炎的哺乳动物，特别是指人。

本发明中所用的术语“药剂学上可接受的辅料”意指在药物制剂领域中常规使用的任何辅料，只要该辅料不对本发明的中药组合物的预期质量和疗效产生不良反应或影响。

本发明中所用的术语“食品或饮料中可接受的添加剂”是指根据国家法律法规和部门规章可以添加到食品或饮料中的任何添加剂，例如香味剂、甜味剂和药食两用的材料等。

本发明中所用的术语“有效量”是指可在受试者中实现预防或治疗所述的呼吸道疾病，或减轻和/或缓解所述呼吸道疾病的一种或多种症状的本发明药物组合物的量。

本申请中公开的所有数值范围包括其端值在内且包括没有明确列出的该范围内的任何小范围。

本发明提供一种用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的药物组合物，其由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

非必要的0.5-8重量份的发酵茶，例如红茶、黑茶或乌龙茶。

在一些实施方式中，所述的药物组合物由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

非必需的2-6重量份，优选3-5重量份的发酵茶，例如红茶、黑茶或乌龙茶。

在具体实施方式中，所述的药物组合物由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在具体实施方式中，所述的药物组合物由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在具体实施方式中，所述的药物组合物由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在具体实施方式中，所述的药物组合物由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在优选的实施方式中，所述的药物组合物为单剂量形式，该单剂量形式由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在优选的实施方式中，所述的药物组合物为单剂量形式，该单剂量形式由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在优选的实施方式中，所述的药物组合物为单剂量形式，该单剂量形式由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在优选的实施方式中，所述的药物组合物为单剂量形式，该单剂量形式由如下重量份的药用形式的中药材或其提取物组成：

在一些实施方式中，所述药物组合物中使用的中药材为经炮制的中药材，例如牛蒡子为炒牛蒡子。

在一些实施方式中，所述药物组合物中使用的中药材是经粉碎的；优选地，粉碎后的药粉通过1号筛；更优选地，粉碎后的药粉通过1号筛并且不能通过5号筛。

在一些实施方式中，所述药物组合物的含水量为小于12％；优选地，小于或等于10％，或者小于或等于8％；更优选地，小于或等于6％，或者小于或等于5％。

本发明还提供一种用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药制剂，其包括如下重量份的药用形式的中药材或其提取物，以及药剂学上可接受的辅料：

非必需的0.5-8重量份的发酵茶。

在一些实施方式中，所述的中药制剂包含如下重量份的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

非必需的2-6重量份，优选3-5重量份的发酵茶，例如红茶、黑茶或乌龙茶。

在具体实施方式中，所述的中药制剂包含如下重量份的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在具体实施方式中，所述的中药制剂包含如下重量份的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在具体实施方式中，所述的中药制剂包含如下重量份的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在具体实施方式中，所述的中药制剂包含如下重量份的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药制剂为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药制剂为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药制剂为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药制剂为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的药用形式的中药材或其提取物以及药剂学上可接受的辅料：

在一些实施方式中，所述的中药组合物被配制成单位剂量形式，其包含2-10g，优选3-6g、3-5g、3-4.5g、4-6g或4-5g，更优选为3g或4.5g的上述任意一种实施方式的药物组合物。

在一些实施方式中，按照每g药物组合物计算，所述的中药制剂中：

牛蒡苷含量≥4.4mg；

优选地，牛蒡苷含量≥5.5mg；

更优选地，牛蒡苷含量≥7mg或≥7.3mg。

在一些实施方式中，按照每4.5g中药制剂计算，所述的中药制剂中：

牛蒡苷含量≥19.80mg；

优选地，

牛蒡苷含量≥20mg。

在一些实施方式中，通过高效液相色谱法检测牛蒡苷的含量，色谱条件如下：

色谱柱：Syncronis-AQ C18(例如250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：乙腈(A)和水(B)；

流速：0.8—1.2mL·min^-1；

波长：230nm；

进样量：5-10μL；

柱温：30℃(20-35℃)；

梯度洗脱程序：0～10min，14％～18％A；10～18min，18％A；18～22min，18％～19％A；22～42min，19％～31％A；42～50min，31％～55％A。

本发明还提供一种用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药口服液，其包括如下重量份的中药材饮片的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

非必需的0.5-8重量份的发酵茶。

在一些实施方式中，所述的中药口服液包含如下重量份的中药材饮片的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

非必需的2-6重量份，优选3-5重量份的发酵茶，例如红茶、黑茶或乌龙茶。

在具体实施方式中，所述的中药口服液包含如下重量份的中药材饮片的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在具体实施方式中，所述的中药口服液包含如下重量份的中药材饮片的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在具体实施方式中，所述的中药口服液包含如下重量份的中药材饮片的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在具体实施方式中，所述的中药口服液包含如下重量份的中药材饮片的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药口服液为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的中药材的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药口服液为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的中药材的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药口服液为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的中药材的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

在优选的实施方式中，所述的中药口服液为单剂量形式，该单剂量形式包含如下重量的中药材的提取液，优选水提液，以及药剂学上可接受的辅料：

本发明还提供一种用于冬季预防和/或治疗呼吸道疾病的中药袋泡茶剂，其包括如下重量份的中药材饮片的粉末以及食品或饮料中可接受的添加剂：

非必需的0.5-8重量份的发酵茶。

在一些实施方式中，所述的中药袋泡茶剂包括如下重量份的中药材饮片的粉末以及食品或饮料中可接受的添加剂：

非必需的2-6重量份，优选3-5重量份的发酵茶，例如红茶、黑茶或乌龙茶。

在具体实施方式中，所述的中药袋泡茶剂包括如下重量份的中药材饮片的粉末以及食品或饮料中可接受的添加剂：

在具体实施方式中，所述的中药袋泡茶剂包括如下重量份的中药材饮片的粉末以及食品或饮料中可接受的添加剂：

在具体实施方式中，所述的中药袋泡茶剂包括如下重量份的中药材饮片的粉末以及食品或饮料中可接受的添加剂：

在具体实施方式中，所述的中药袋泡茶剂包括如下重量份的中药材饮片的粉末以及食品或饮料中可接受的添加剂：

本领域技术人员理解，上述中药材的重量份是相对的，可以基于中医药学理论，根据实际需要，对其中一种或多种中药材的量进行合理调整。如此合理调整量的组方的所有显而易见的变化形式都在本发明的范围之内。

如上所述，根据本发明的中药制剂除包含本发明的中药组合物外，还可以包含药剂学上可接受的辅料。可用于本发明的中药组合物中的药剂学上可接受的辅料包括中药制剂中常用的任何辅料，只要该辅料不对本发明的中药组合物的质量、性能和治疗效果产生不利影响即可。中药制剂中常用的辅料包括稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。常用的稀释剂主要有蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、双歧糖等。常用的润湿剂主要有水、不同浓度的乙醇等；常用的粘合剂包括高分子粘合剂，其种类非常多，如乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、海藻酸钠等。常用的崩解剂包括微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等。本领域技术人员根据本说明书公开的内容能够选择和确定本发明的中药制剂中适用的辅料。特定辅料的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。

必要时，本发明的中药制剂中还可以包含适用的添加剂。这些添加剂是本领域中已知的，例如乳化剂、芳香剂、增溶剂、抗结剂、消泡剂、粘合剂、缓冲剂、pH调节剂、推进剂、螯合剂以及防腐剂等。

本领域技术人员根据本说明书中所述的方法和本领域中的已知技术可以轻易地制备得到本发明的中药组合物和中药制剂。

例如，本领域技术人员可以通过包括如下步骤的方法制备得到本发明的药物组合物：

(1)将各药材分别粉碎，过1号筛和5号筛，得到1号筛和5号筛之间的粗粉；优选地，将1号筛上粉再次粉碎并过1号筛和5号筛，得到1号筛和5号筛之间的粗粉，与前面得到的粗粉合并；

(2)将得到的粗粉混合均匀；

(3)包装，灭菌；

优选地，步骤(1)中，牛蒡子与赤芍一起进行粉碎；优选地，其余药材单独粉碎或者一起粉碎。

在此基础上，本领域技术人员根据本说明书中所公开的内容和本领域中的已知技术可以轻易地制备得到所需剂型的本发明的中药制剂。

对于制备本发明的中药制剂的过程中所涉及的提取、过滤、浓缩、干燥和分装等步骤，本领域技术人员可以本领域中常用的方法和设备实施完成，例如提取液或滤液过滤采用例如100-300目筛过滤。

本领域技术人员理解，在本说明书公开内容的基础上，可以使用相应的中药材单独或它们的混合物，通过本领域中常规粉碎、浸提和分离方法，例如浸渍、渗滤、液-液萃取、水提醇沉、醇提水沉和透析等方法，制备得到本发明中适用的中药活性提取物和中药制剂。还可以通过商业途径购买本发明中所用中药的一种或几种的活性提取物，然后与其余中药的提取物配伍，得到本发明的中药活性提取物。这些变化形式的中药组合物和中药制剂都在本发明的范围之内。

本发明的药物组合物和药物制剂可以被被制成单位剂量形式。术语“单位剂量形式”意指适合于作为用于人体受试者和其它哺乳动物的单位剂量的物理分散单位，每个单位包含计算产生所需治疗作用的预定量的本发明的药物组合物、药物制剂与适合的药剂学上可接受的辅料。

本发明的中药组合物和中药制剂可显著抑制LPS诱导THP-1细胞的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放，提示有抗炎作用。急性咽炎大鼠模型结果表明，本发明的药物组合物和中药制剂对病原微生物例如金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎有明显的预防与治疗作用。

因此，本发明的中药组合物和中药制剂可用于如下1)-4)项中一项、多项或全部所述的用途：

1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊；

2)治疗和/或预防季节性呼吸道疾病，优选地，所述呼吸道疾病为流感；

3)治疗和/或预防咽炎，优选地，所述咽炎为急性咽炎；

4)祛痰；

5)止咳；

包括给予有需求的受试者以有效量的本发明的中药组合物和中药制剂，例如作为袋泡茶剂，每次1袋(3g/袋或4.5g/袋)，每天2-3次。。

或者，本发明的中药组合物可用于制备用于如下(1)-(4)项中一项、多项或全部所述的药物：

(1)益气润肺、清喉利咽和/或去秽化浊的药物；

(2)治疗和/或预防咽炎的药物；优选地，所述咽炎为急性咽炎；；

(3)祛痰药物；

(4)止咳药物。

可以通过本领域中常用的任意适用的方式和任意适用的形式施用本发明的中药组合物和中药制剂。优选，本发明的中药组合物和中药制剂通过口服给药。例如，可以一日两次口服本发明的中药组合物和中药制剂，每次5-30克，例如10-20克，优选10克本发明的中药组合物和中药制剂。具体给药的剂量取决于被治疗的受试者的体重、疾病的性质和严重程度、药物的给药方式以及给药周期或时间间隔等因素。对于某些情况特殊的患者，具体给药应遵医嘱。

本发明的中药组合物和中药制剂可以与本领域中已知的其它可用于预防和治疗呼吸道疾病的药物和技术联合使用。

预期中药组合物和中药制剂能够产生如下(1)-(5)项中一项、多项或全部所述的技术效果：

(1)养阴利咽；

(2)益气润肺、清喉利咽、去秽化浊；

(3)能够有效地治疗和/或预防咽炎；

(4)能够有效地祛痰；以及

(5)能够有效地止咳。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器如未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的实验例中用到的本发明药物组合物药液，其配制方法均为用常温蒸馏水配制成所需浓度的药液，超声20分钟使药液充分混合，不需要除去药渣；取上清液用于给药、进一步稀释或存储备用。

制备例1：本发明的药物组合物和制剂的制备

处方：

上述各药味单独粉碎，过筛成全部通过1号筛(10目)和5号筛(80目)之间的粗粉，按处方配比投料1000个处方量总计27.0kg称重，将所得粉末放入混合机进行总混(总混的目的是让所有药材粉末混合均匀)60分钟，共得药粉量为26.9kg。灭菌后，采用热封型茶叶滤纸包装，包装成3g/袋或4.5g/袋(内包装过程收率98-99.5％)，再外包装即得成品(批号：SJD2020001)。

制备例2：本发明的药物组合物和制剂的制备

处方与制备例1相同。

上述药味按处方配比投料1000个处方量总计27.0kg称重，将饮片混合后进行粉碎，粉碎成能全部通过1号筛(10目)和5号筛(80目)之间的粗粉，将所得粉末放入混合机进行总混(总混的目的是让所有药材粉末混合均匀)30分钟，共得药粉量为26.8kg。采用热封型茶叶滤纸包装，包装成3g/袋或4.5g/袋(内包装过程收率98-99.6％)，灭菌后，外包装即得成品(批号：SJD202001)。

制备例3：本发明的药物组合物和制剂的制备

处方与制备例1相同。

上述药味按处方配比投料1000个处方量总计27.0kg称重，将饮片混合后进行粉碎，粉碎成能全部通过1号筛和5号筛(80目)之间的粗粉，将所得粉末放入混合机进行总混(总混的目的是让所有药材粉末混合均匀)30分钟，共得药粉量为26.7kg。灭菌，采用热封型茶叶滤纸包装，包装成3g/袋或4.5g/袋(内包装过程收率99.7％)，再外包装即得成品(批号：SJD2020002)。

实验例1：质量检测和控制

现用薄层色谱法(TLC)对样品中的主要药物之一赤芍和主要药物之一射干进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)对主要成分之一牛蒡苷进行含量测定。根据茶剂标准(2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188)，进行全面的质量标准研究，为制剂的进一步研究提供科学有效的依据。

1实验材料与实验方法

1.1实验材料与试剂

1.1.1仪器

1.1.2试剂与材料

1.1.3对照品

含量测定用对照品：牛蒡苷(批号：110819-201812，纯度：95.0％)购自中国食品药品检定研究院。

薄层鉴别用对照品芍药苷(批号：110736-201943，纯度：95.1％)，次野鸢尾黄素(批号：11557-201703，纯度：99.9％)以及射干对照药材(批号：120994-201206)均购自中国食品药品检定研究院。

1.1.4样品

按照制备例1-3制得的本发明的药物组合物(SJD2020001、SJD202001、SJD2020002、SJD2020003和SJD2020004)，同时同法制备缺赤芍、射干和虎杖各一批样品作为阴性对照。

阴性对照1除了不含赤芍之外，其它药材、用量以及制备工艺均与制备例3相同。设置阴性样品的目的是为了证明样品中赤芍的鉴别方法是可靠的，表明样品中确实有赤芍中芍药苷的特征斑点，并且除赤芍外其它药材中没有芍药苷。

阴性对照2除了不含射干之外，其它药材、用量以及制备工艺均与制备例3相同。设置阴性样品的目的是为了证明样品中射干的鉴别方法是可靠的，表明样品中确实有射干中次野鸢尾黄素对照品(111557-201703)的特征斑点，并且除射干外其它药材中没有次野鸢尾黄素。

阴性对照3除了不含虎杖之外，其它药材、用量以及制备工艺均与制备例3相同。设置阴性样品的目的是为了证明样品中虎杖的鉴别方法是可靠的，表明样品中确实有虎杖中虎杖苷对照品的特征斑点，并且除虎杖外其它药材中没有虎杖苷。

1.2实验方法

1.2.1薄层鉴别

1.2.1.1赤芍薄层鉴别

(1)供试品及阴性供试品溶液制备

取样品(制备例3制得)的药粉2g，加乙醇40mL，振摇滤过，滤液蒸干，残渣 加乙醇5mL，溶解，作为供试品溶液。

取阴性对照1，同法制成阴性对照溶液。

(2)对照药材溶液的制备

取赤芍对照药材0.5g，同1.2.1.1项(1)下方法制成对照药材溶液。

(3)对照品溶液配制

取芍药苷对照品2mg，加乙醇制成对照品溶液(2mg·mL^-1)。

(4)薄层色谱展开条件

薄层板：硅胶G薄层板

点样量：上述各溶液5μL

展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)

显色剂：5％香草醛硫酸溶液，105℃加热显色

1.2.1.2射干薄层鉴别

(1)供试品及阴性供试品溶液制备

取样品(制备例1-3制得)的药粉2g，加乙醇40mL，振摇滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5mL，溶解，作为供试品溶液。

取阴性对照2，同法制成阴性对照溶液。

(2)对照药材溶液的制备

取射干对照药材0.5g，同1.2.1.1项(1)下方法制成对照药材溶液。

(3)对照品溶液配制

取次野鸢尾黄素对照品2mg，加乙醇制成对照品溶液(2mg·mL^-1)。

(4)薄层色谱展开条件

薄层板：硅胶G薄层板

点样量：上述各溶液5μL

展开剂：石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯(1:1)

显色剂：254nm下观察

1.2.1.3虎杖薄层鉴别

(1)供试品及阴性供试品溶液制备

取样品(制备例1-3制得)的药粉2g，加甲醇20mL，超声处理20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇4ml使溶解，作为供试品溶液。

取阴性对照3，同法制成阴性对照溶液。

(2)对照药材溶液的制备

取射干对照药材0.5g，同1.2.1.1项(1)下方法制成对照药材溶液。

(3)对照品溶液配制

取虎杖对照品加乙醇制成对照品溶液(1mg·mL^-1)。

(4)薄层色谱展开条件

薄层板：硅胶G薄层板

点样量：供试品溶液4～8μL、对照品溶液1～2μL

展开剂：二氯甲烷-甲醇-二乙胺(10:3:0.1)

显色剂：300nm紫外灯下检视

1.2.2检查

根据2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188检查。

1.2.2.1水分测定

根据2015版《中国药典》第四部水分测定法(通则0832)进行测定。

1.2.2.2装量差异

分别取制备例1-3制得样品各一批，每批10袋，根据2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188项下的“装量差异”方法检查，本品为3g，装量差异应在±12％。

1.2.2.3微生物限度

分别取制备例1-3制得样品各一批，每批3袋，根据2015版《中国药典》第四部通则茶剂0188项下的“微生物限度”方法检查。

1.2.3含量测定

分别取制备例1-3制得样品各一批，各3份，每份3g。

样品制备：取3g样品置于烧杯中，加入180mL 85℃纯水，浸泡30min；取样品加甲醇超声30min，冷却，转移至离心管，室温离心15min(5000rpm)，上清液转移至10mL容量瓶，用90％甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得，备用。

色谱条件：色谱柱：Syncronis-AQ C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)；流速：0.8mL·min^-1；波长：230nm；进样量：10μL；柱温：30℃。梯度洗脱程序：0～10min，14％～18％A；10～18min，18％A；18～22min，18％～19％A；22～42min，19％～31％A；42～50min，31％～55％A。理论塔板数按牛蒡苷峰计算不低于5000。

2实验结果

2.1薄层鉴别结果

薄层结果见图1A、图1B和图1C。

由图1A可见，本发明药物组合物样品中均有芍药苷的特征斑点，同时缺赤芍的阴性样品未见芍药苷的特征斑点，说明该方法可以用于样品中赤芍的鉴别。

由图1B可见，本发明药物组合物样品中有次野鸢尾黄素的特征斑点，同时缺射干的阴性样品未见次野鸢尾黄素的特征斑点，说明该方法可以用于样品中射干的鉴别。

由图1C可见，本发明药物组合物样品中有虎杖苷的特征斑点，同时缺虎杖的阴性样品未见虎杖苷的特征斑点，说明该方法可以用于样品中虎杖的鉴别。

2.2茶剂通则检查结果

2.2.1水分检查结果

如表1所示。

表1：水分检查结果

由表1可见，水分均低于12％，符合茶剂要求。

2.2.2装量差异检查结果

如表2所示。

表2：装量检查结果

由表2可见，装量差异均符合茶剂要求。

2.2.3微生物检查结果

3批样品微生物检测结果符合规定。

2.3含量测定结果

外标法计算含量，取平均值，结果如表3所示。

表3：三批样品含量测定结果(n＝3)

为了更有代表性地确定本发明药物组合物的指标成分含量限度，本发明人以药典中牛蒡苷含量标准为依据，确定本发明药物组合物的指标成分含量限度。具体内容如下：

依据2015版中国药典中规定炒牛蒡子饮片中牛蒡苷5.0％，按照茶剂制备工艺，牛蒡子在处方中质量占比为11.1％，结合三批次中试放大生产本发明药物组合物平均收率为99.0％，计算为5.5mg/g，下浮20％为4.4mg/g，每袋(4.5g)为19.8mg作为本发明药物组合物中牛蒡苷含量的标准。

本发明药物组合物的含量限量标准：本发明药物组合物每袋含牛蒡子以牛蒡苷(C₂₇H₃₄O₁₁)计不少于19.8mg。

实验例2：本发明药物组合物对金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎大鼠模型的预防与治疗作用

本实验中采用金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎大鼠，从表观指标、病理学指标、生化指标三方面评价了本发明药物组合物的药效作用，为本发明药物组合物的临床应用提供了科学依据。

1材料与方法

1.1实验仪器

1.2试剂

1.3受试药物

本发明药物组合物样品(制备例3制得)。

1.4阳性药物

阿莫西林胶囊，山东淄博新达制药有限公司。批号：191040，在有效期内。规格：0.25g/片，用法用量：参照临床用法，造模第一天开始给药，剂量与临床等效，每只大鼠ig 0.36g/kg，1次/日，连续5天。

1.5试验动物

SPF级SD大鼠，雌雄不限，体重180～220g；由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：1103222011009608，许可证号：SCXK(京)2019-0008。饲养条件：ABSL-2实验室，-20Pa，温度22±1℃，湿度40～50％。

1.6金黄色普通球菌

金黄色葡萄球菌标准菌株6538购自ATCC。

1.7剂量设计和药物配制

1.7.1本发明药物组合物提取物：人临床用量为9g/70kg/d，试验大鼠用量为3.5g/kg/次，相当于临床16倍剂量。

药液配制：试验前用蒸馏水配制成0.35g/ml浓度的药液，按1ml/100g体重/次灌胃给药，2次/日，预给药7天后造模并继续灌胃给药5天。

1.7.2阿莫西林胶囊：参照临床用法。第1天感染金黄色葡萄球菌后1h阳性药组开始灌胃给予0.36g/kg(相当于人临床用量的等倍)剂量，1次/日，连续5天。

药液配制：试验前用蒸馏水将胶囊里面的颗粒配制成36mg/ml浓度的药液，4℃保存备用。

1.8细菌培养

取2个250ml锥形瓶，每个锥形瓶中加入1g酵母浸膏、2g蛋白胨、2g氯化钠、200ml去离子水并混合均匀，配制成LB培养基，放入4℃层析柜中保存备用。

取金黄色葡萄球菌菌落接种于装有LB培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养17h。菌液3220rcf，离心1min后，弃上清，显微镜下计数；调整菌液密度为1.9x10⁹/ml。

1.9分组与检测

SD大鼠28只，随机分为正常组、模型组、本发明药物组合物组、阿莫西林组，每组7只。

本发明药物组合物给药组灌胃预给药七日，剂量3.5g/kg，一日两次；七天后除正常组外，其余各组于咽部注射金黄色葡萄球菌液造模，1x10⁸/只，连续两日，造模同时持续给药；阿莫西林组于造模第一天开始灌胃给药，给药剂量为0.36g/kg，一日一次。造模结束后本发明药物组合物给药组及阿莫西林组再继续给药三天，第四天称重解剖，进行观察和检测。

1.9.1咽部病变打分

评分标准(出自中华中医药学会中药实验药理专业委员会制定的《急性咽炎动物模型制备规范》(草案)，中药药理与临床2018；34(1))：根据组织的颜色，光泽，分泌物多少，咽部充血和肿胀程度，可分为4个等级。

“-”：咽组织浅红色，表面湿润有光泽，无分泌物，无充血，肿胀等病理现象；

“+”：咽部粘膜光泽度差，有少量分泌物和轻度充血、肿胀；

“++”：咽部黏膜颜色为深红色，光泽度差，出现分泌物，并伴有中度充血，肿胀等现象；

“+++”：咽部黏膜呈暗红色，粘液分泌增加，明显的充血和肿胀。

1.9.2大鼠外观行为表征打分

评分标准(出自中华中医药学会中药实验药理专业委员会制定的《急性咽炎动物模型制备规范》(草案)，中药药理与临床2018；34(1))：根据大鼠体重、活动能力、皮毛色泽的情况，可分为4个等级。如下面的表4所示。

表4

1.9.3大鼠血白细胞计数及其分类计数检测

各组动物处死前，断尾取血涂片进行血常规白细胞数目、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比的测定。

1.9.4病理学检测观察

1.9.4.1组织石蜡包埋切片

取材：大鼠麻醉，取咽部组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精1h-85％酒精1h-90％酒精1h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。

包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

1.9.4.2 HE染色

石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 30min-二甲苯Ⅱ 30min-无水乙醇Ⅰ 10min-无水乙醇Ⅱ 10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染5-10min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗10min，PBS返蓝5min，流水冲洗。

伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。

脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-二甲苯Ⅰ 5min-二甲苯Ⅱ 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

显微镜镜检，图像采集分析。

1.9.5大鼠血清炎性因子检测

麻醉大鼠，腹主动脉取血，注入促凝管后于室温静置45min，3500rpm离心10min，吸取上清至无菌EP管内-80℃保存。测定前使样本置于室温中复融，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中IL-1β，IL-6和TNF-α水平，操作依据试剂盒说明进行，酶标仪450nm吸光度检测各指标。

2实验结果

2.1本发明药物组合物对急性咽炎大鼠外观行为和咽部打分的影响

如表5和表6所示。

表5:本发明药物组合物对急性咽炎大鼠外观行为表征的影响

注：与正常组比较，^**P<0.01；与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

表6:本发明药物组合物对急性咽炎大鼠咽部病变的影响

表5结果显示：与正常组相比，模型组大鼠体重明显下降(P<0.01)；胸腺重量下降显著(P<0.01)；模型组表现出扎堆不动现象，精神状态欠佳，活动能力明显下降(P<0.01)；模型组皮毛干涩、暗淡无光，皮毛色泽评分显著升高(P<0.01)；

与模型组大鼠比较，本发明药物组合物给药组大鼠的体重、胸腺重量增加，活跃程度明显升高，与阿莫西林组大鼠的行为表征一致。

表6结果显示，正常组大鼠咽部炎症反应均为“-”级，无炎症特征出现。模型组咽部炎症反应为“++”和“+++”级，咽粘膜和组织病变明显，造模成功。本发明药物组合物给药组，大部分伴有少量分泌物和轻度充血、肿胀，炎症症状明显改善，呈现“+”级，偶有“-”和“++”阿莫西林给药后与本发明药物组合物组大鼠的咽部病变恢复情况一致，大部分呈 现“+”级，偶有“++”级。

2.2本发明药物组合物对急性咽炎大鼠外周血白细胞计数及其分类的影响

如表7所示。

表7:本发明的药物组合物对急性咽炎大鼠白细胞计数及分类的影响

注：WBC(×10⁹/L)：白细胞；L(％)：淋巴细胞的百分比；N(％)：中性粒细胞的百分比。

与正常组比较，^**P<0.01；与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

表7结果显示：与正常组相比，大鼠急性咽炎模型组白细胞数目有所升高(P<0.05)，淋巴细胞百分比明显降低，中性粒细胞显著升高(P<0.01)；与模型组比较，本发明药物组合物组和阿莫西林组大鼠淋巴细胞百分比升高(P<0.01)，中性粒细胞降低(P<0.01)。

2.3本发明药物组合物对急性咽炎大鼠咽部组织病理形态学的影响

如图2A-图2D所示，正常组大鼠咽部组织结构清晰，黏膜上皮光滑，未见有增厚，固有层散在淋巴组织和腺体，腺体形态正常，黏膜下有少量小血管，无肉芽组织出现，肌层纤维排列紧密。模型组大鼠咽部组织分界不清，黏膜上皮角化、有上皮脱落现象，固有层和黏膜下血管增多、充血，可见大量炎性细胞浸润，腺体壁相比正常组明显增厚，大部分黏液腺上皮细胞坏死，可见大量肉芽组织生长；肌肉层纤维排列疏松。本发明药物组合物给药组大鼠咽部黏膜上皮渐恢复平整，腺体壁恢复到正常水平，黏膜和黏膜下炎性细胞浸润程度明显减少，肌层纤维排列紧密；阿莫西林组大鼠咽部黏膜恢复情况与本发明药物组合物组相似，提示给药后咽部病理情况有所改善。

2.4本发明药物组合物对急性咽炎大鼠外周血炎症因子含量的影响

如下面的表8以及图3、图4和图5所示。

表8：本发明的药物组合物对急性咽炎大鼠外周血炎症因子含量的影响

注：与对照组比较，^**P<0.01；与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

表8结果显示:与正常组比较，急性咽炎模型组大鼠外周血中炎性因子TNF-α和IL-1β的含量明显升高(P<0.01)，IL-6含量有所降低；与模型组相比，与模型组相比，本发明药物组合物和阿莫西林组能抑制大鼠外周血中TNF-α、IL-1β表达(P＜0.01)。

3小结

本发明药物组合物可显著改善急性咽炎大鼠咽部黏膜病变情况，增加大鼠体重和胸腺重量，提高大鼠活动能力、改善大鼠皮毛状态，抑制急性咽炎大鼠白细胞数目增多，淋巴细胞百分比升高，中性粒细胞降低，减轻感染后大鼠咽部组织病理损伤程度，亦可显著降低急性咽炎大鼠血清中TNF-α含量。表明：本发明药物组合物对金黄色葡萄球菌引起的急性咽炎大鼠模型有明显的预防与治疗作用，为急性咽炎临床用药提供实验室依据。

实验例3：本发明药物组合物对LPS诱导的THP-1炎性因子表达的作用研究

本实验考察本发明药物组合物对LPS诱导的人单核细胞THP-1细胞因子TNF-α、IP-10、IkBα、IL-6和IL-1β释放的影响，初步探讨本发明药物组合物的抗炎作用。

1材料与方法

1.1实验仪器

1.2试剂

1.3实验药物

本发明药物组合物(制备例3制得)。

1.3.1溶解本发明药物组合物

精密称取本发明药物组合物2.5mg于1ml双蒸水中，得2.5mg/ml的本发明药物组合物标准储备液，采用双蒸水逐级稀释的方式配置其2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的样品溶液

1.3.2溶解LPS

将1mg LPS在21℃以下离心机中快速离心，加入1mL ddH₂O充分溶解，用滤器进行过滤后，进行分装，方便实验过程中使用，置于-20℃保存。

1.4细胞培养

1.4.1 THP-1细胞传代

本实验中所用THP-1细胞购买自ATCC,为悬浮细胞，所以传代时不需要离心，取20mL含有10％热灭活胎牛血清和1％双抗的RPMI细胞培养液加入到75cm²细胞培养瓶中，再将原25cm²培养瓶中的10mL细胞液加入，放入37℃恒温二氧化碳细胞培养箱继续培养。

1.4.2 THP-1细胞冻存

将THP-1细胞在800rmp条件下离心5分钟，弃去上清液。根据实际情况取适量的细胞冻存液使细胞沉淀迅速重悬，按照1mL/管注入冻存管中，将冻存管放入异丙醇冻存盒，-80℃进行梯度降温后，将细胞转移至液氮罐中保存。

1.4.3 THP-1细胞复苏

从液氮中取出冻存管，迅速放于37℃水浴中，快速震荡将细胞融化。将细胞移出冻存管，加入4mL培养液，混匀后在800rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用4mL培养液重悬，后加培养液至10mL，加入至25cm²的培养瓶中，放入37℃恒温二氧化碳细胞培养箱培养3-4天，当每毫升的细胞数达到1×10⁶时即可进行传代培养。

1.4.4 THP-1细胞计数

取干净的细胞计数板，盖上盖玻片，将10μL分散均匀的细胞悬液从盖玻片与计数板的边沿加入使之充满计数板和盖玻片之间。置倒置显微镜镜下观察，计算四个方格区域内的细胞数，压线细胞只计算左线和上线细胞，成团细胞按单个细胞计算。

按照以下公式计算细胞密度：

细胞数/mL＝(四个方格区域内的细胞数)/4×10⁴×稀释倍数

1.5细胞活力检测

本实验使用CCK-8、LDH试剂盒考察不同浓度的本发明药物组合物对THP-1细胞活力的影响。

取对数生长期的THP-1细胞，以1×10⁶个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，将2.5-0.5μg/ml的本发明药物组合物分别加到细胞培养孔中，每孔1μL，每个浓度6个复孔，同时设置未加入药物的对照组，分别做CCK8和LDH。培养24h后，吸取上清液置于另一新96孔板中，按LDH试剂盒操作于490nm处测定吸光度(OD值)。另96孔板每孔加入10μL CCK-8液，37℃孵育1h。置酶标仪于450nm处测定吸光度(OD值)。

1.6建立LPS诱导的THP-1细胞炎症模型

THP-1细胞以1×10⁶/mL密度接种于6孔板，24h后分组处理细胞。模型组加入终浓度为100ng/mL的LPS；对照组用双蒸水代替LPS；药物处理组的培养基除加入LPS外，还分别加入终浓度含25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml本发明药物组合物提取物，本发明药物组合物预刺激4h后，再加LPS刺激16h后收集细胞待测。

1.7提取细胞RNA

(1)收集经过处理后的细胞悬液于15mL的离心管中，1000rmp离心3分钟，弃去上清，收集其中的细胞。

(2)向细胞沉淀中加入1ml TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

(3)以每1ml TRIzon Reagent加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。

(4)4℃，12,000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase Free离心管(自备)中。

(5)在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。

(6)12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

重复步骤(8)。

(9)12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。

(10)将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

(11)使用RNA浓度测定仪测定RNA浓度，取1.5μL的RNA溶液测其浓度，以RNase-Free Water作为空白对照。在RNA浓度测定仪器上分别读取总RNA的浓度(ng/μL)以及OD260/280、OD 260/230的数值。

1.8 RNA反转录及实时定量PCR

1.8.1 RNA反转录

在冰上进行下列操作，按照表9配制20μL的反应体系，涡旋剧烈震荡，将反应体系混匀后，短暂离心将侧壁的溶液收集到管底，42℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟，结束后样品置于冰上进行冷却。

表9：反转录体系

1.8.2实时定量PCR

在冰上按照表10所列的配方用实时定量PCR试剂盒来配制20μL的PCR反应体系。配制好之后进行涡旋，使反应体系充分混合均匀，离心后进行实时定量PCR实验。在本实验中设置实时定量RT-PCR的反应循环条件为：95℃10s、60℃30s、共循环40次。添加熔解曲线：50℃到99℃之间。本实验中涉及到的引物序列见表11。

经检测得Ct值，ΔCt是待测基因Ct值与内参照基因Ct值的差值，分析反应板的数据，获得每个样品每次反应相应的Ct值，计算得到其ΔCt，与对照组相比后，取2^-ΔΔCt的数值进行统计。

表10：PCR反应体系

表11：实验相关引物序列

1.9统计方法

实验数据使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)评估均值之间的差异，P<0.05时认为具有统计学差异，数据表示为平均值±S.E.M.。

2实验结果

2.1本发明药物组合物对THP-1细胞的无毒剂量的筛选

用CCK-8和LDH法检测本发明药物组合物在25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml时，对THP-1细胞活力的影响。结果显示，5μg/ml、10μg/ml本发明药物组合物组THP-1细胞活力与正常对照组相比无显著性差异。采用药物的安全浓度探讨本发明药物组合物的抗炎作用(图6A-图6B)。

2.2对THP-1细胞TNF-α、IP-10、IKBα、IL-6和IL-1β分泌的抑制作用

与对照组比较，LPS刺激明显诱导THP-1细胞的TNF-α、IP-10、IKBα、IL-6和IL-1β的mRNA表达的显著升高；与LPS刺激组比较，10μg/ml的本发明药物组合物可以显著抑制炎性THP-1细胞的TNF-α、IP-10、IKBα、IL-6和IL-1β的mRNA表达，提示本发明药物组合物可以抑制LPS诱导的细胞因子释放(图7A-图7E)。

3小结

本发明药物组合物可显著抑制LPS诱导THP-1细胞的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放，提示有抗炎作用。

实验例4：本发明药物组合物抗氧化/抗炎药效学实验研究

本实验基于ARE和NF-κB的荧光素酶报告基因系统考察本发明药物组合物对 ARE、NF-κB活性的影响，初步探讨本发明药物组合物的抗氧化、抗炎作用。

1材料与方法

1.1实验仪器

1.2试剂

1.3受试药物

本发明药物组合物处方浸泡提取2次，每次10倍量沸水，浸泡40分钟，过滤，60℃以下，浓缩到糖度15-17Brix,喷雾干燥制得。

1.4阳性药物

地塞米松，MedChemExpress公司。批号：HY-14648，在有效期内。规格：500mg，用法用量：参照临床用法，配置成10mM母液。

tBHQ((Tertiary butylhydroquinone，特丁基对苯二酚)，MedChemExpress公司。批号：HY-100489，在有效期内。规格：500mg，用法用量：参照临床用法，配置成100mM母液。

1.5试验细胞

293T细胞，购于ATCC细胞库。

1.6感受态细胞DH5a

感受态细胞DH5a购自天根生化科技有限公司

1.7剂量设计和药物配制

本发明药物组合物：0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL。

药液配制：试验前用蒸馏水将药粉配制成100mg/ml浓度的药液，使用时稀释成实验浓度。

1.8质粒提取

1.8.1 LB液体培养基的制备

将三角瓶经高温高压灭菌后，向瓶内加入2.5g LB液体培养基干粉，并加入100mL灭菌的超纯水使其溶解完全，瓶口贴上滤膜后，于高温高压下灭菌。待冷却至55℃左右时，加入100mg/mL氨苄西林100μL，混匀即得。细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中，待培养瓶内细胞长至80-90％时进行传代。

1.8.2 LB固体培基的制备

取LB固体培养基干粉0.4g，LB液体培养基干粉0.3g于经高温高压灭菌的三角瓶中，加入灭菌超纯水20mL，加热煮沸，搅拌溶解，高压灭菌，待冷却至50-60℃时，加入50μL氨苄西林(50μg/mL)，混匀即得。将上述溶液分装于培养皿中，待冷却凝固后，盖上盖子，倒置，于4℃冰箱中保存。

1.8.3质粒载体的转化与验证

轻微混匀感受态细胞DH5a后取100μL于15mL离心管中，加入1μL质粒pGL4.37样品，置于冰上30min，立刻转入42℃水浴中孵育45s，后转置冰中停留1-2min，完成感受态细胞的转化。吸取上述转化的感受态细胞100μL到适量LB液体培养基中，混匀。用无菌的涂布器取适量上述菌液均匀涂布于LB固体培养基上，于室温放置至菌液完全被吸收。于37℃条件下倒置培养12h。

在生物安全柜中，挑取6个单克隆菌粒，分别加入到6个含有适量LB液体培养基的锥形瓶中得标号1-6的6份菌液样品。将上述样品于37℃恒温，160rpm振荡12h后，各编号样品各取1mL于离心管中，送华大基因测序，鉴定阳性克隆。

1.8.4质粒的提取及测定

(1)向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm，离心1min，尽量吸除上清，菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，彻底悬浮菌体沉淀。

(4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分地裂解。

(5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀后，12000rpm离心10min。

(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(7)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm，离心2min。

(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm，离心2min，取上清于干净的离心管中，即得质粒溶液。

(11)取1μL质粒溶液，以DEPC水作空白对照。在紫外分光光度计上分别读取260nm、280nm波长下的光密度值。

1.9细胞培养

1.9.1 293T细胞复苏

将293T细胞株从液氮罐中取出，立即放入37℃的恒温水浴锅中，轻微晃动，使其快速融化。冻存管经酒精棉擦拭后转入生物安全柜，用移液枪将细胞吸至加入完全培养基的离心管中，1000rpm，4℃，离心3min，弃掉上清液，加入5mL完全培养基，用移液枪吹散均匀后转移到25cm²的培养瓶中。于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。24h后更换培养瓶内的培养液。根据细胞的生长状态进行传代培养。

1.9.2 293T细胞传代

在DMIL倒置相差显微镜下观察细胞，待培养瓶内细胞长至80-90％时进行传代。从培养箱中取出培养瓶，弃掉瓶内培养液，加入2mL PBS缓冲液润洗两次，加入500μL0.25％的胰酶(含0.25％EDTA)，消化约15s，至细胞大部分凸起变圆，加入1mL完全培养基终止消化。将细胞悬液转入离心管内，1000rpm，4℃，离心3min。弃上清，加入4mL完全培养基轻轻吹打至细胞分散均匀，1:4传至新的培养瓶。

1.9.3 293T细胞计数

取干净的细胞计数板，盖上盖玻片，将10μL分散均匀的细胞悬液从盖玻片与计数板的边沿加入使之充满计数板和盖玻片之间。置倒置显微镜镜下观察，计算四个方格区域内的细胞数，压线细胞只计算左线和上线细胞，成团细胞按单个细胞计算。

按照以下公式计算细胞密度：

细胞数/mL＝(四个方格区域内的细胞数)/4×10⁴×稀释倍数

1.9.4药物溶液的配制

分别精密称取本发明药物组合物2.5于2.5ml水中，得100mg/ml的本发明药物组合物标准储备液，采用DMEM培养基逐级稀释的方式配置其100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的样品溶液。

1.10分组与检测

细胞毒性检测分为空白对照组以及0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL 5个本发明药物组合物浓度组；

抗氧化活性检测分为空白对照组、阳性药tBHQ组以及0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mLμg/mL 5个本发明药物组合物浓度组；

抗炎作用检测分为空白对照组、模型组、阳性药地塞米松组以及0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mLμg/mL 5个本发明药物组合物浓度组。

1.10.1细胞毒性实验

本实验使用CCK-8、LDH试剂盒考察不同浓度的本发明药物组合物对293T细胞活力的影响。

取对数生长期的293T细胞，以2×10⁵个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，贴壁生长达70％-80％后，将0.01-100μg/mL的本发明药物组合物分别加入不同的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度6个复孔，同时设置未加入药物的对照组，重复3次。培养24h后，吸取上清液置于另一新96孔板中，按LDH试剂盒操作检测LDH释放量。原96孔板用PBS清洗1次后每孔加入100μL稀释的1×CCK-8工作液，37℃孵育1h。置酶标仪于450nm处测定吸光度(OD值)。

按下列公式，计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％

其中As代表实验孔的吸光度，Ab代表空白孔的吸光度，Ac代表对照孔的吸光度。

1.10.2 293T细胞瞬时共转染及ARE和NFκB活性的测定

1.10.2.1 293T细胞瞬时共转染

取对数生长期的293T细胞，以2×10⁵个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，待 细胞生长密度达到70％-80％时，使用PEI(1mg/mL)转染试剂同时转染ARE、NF-κB荧光素酶报告质粒pGL4.37、pGL4.32(100ng/孔)和海肾荧光素酶报告质粒pGL4.75(10ng/孔)，培养24h。

1.10.2.2双荧光素酶报告系统检测分析测定ARE和NFκB转录活性

培养24h后，转染ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37的细胞，分别加入tBHQ(10μM)、安全浓度的本发明药物组合物各组样品溶液，并设置对照组，培养6h；转染NF-κB荧光素酶报告质粒pGL4.32的细胞，分别加入TNF-α全培稀释的地塞米松(10μM)、安全浓度的本发明药物组合物各组样品溶液，并设置对照、模型组，培养6h。弃上清液，PBS漂洗细胞，裂解后用Dual-Luciferase检测系统检测。每组实验设置6个复孔，重复3次。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比得到相对荧光素酶活性值。L/S＝Luciferase活性值/Renilla活性值。

2实验结果

2.1本发明药物组合物对293T细胞毒性的测定

0.01-1μg/ml本发明药物组合物组293T细胞活力与正常对照组相比无显著性差异，为药物对293T细胞安全浓度。采用药物的安全浓度探讨本发明药物组合物的抗氧化、抗炎作用(见图8A-8B)。

2.2本发明药物组合物对ARE报告基因活性的影响

采用293T细胞转染对本发明药物组合物样品溶液进行抗氧化活性验证。结果显示，1μg/ml本发明药物组合物可显著诱导ARE荧光素酶活性(P<0.05)(见表12，图9A)。

表12：不同浓度本发明药物组合物对293T细胞ARE荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)

注：***P<0.001vs对照

2.3本发明药物组合物对NF-κB报告基因活性的影响

采用293T细胞转染NF-κB启动子荧光素酶报告质粒，检测本发明药物组合物的抗炎活性。结果显示，0.01μg/mL本发明药物组合物能显著抑制TNF-α诱导的NF-κB启 动子的活性(P<0.05，P<0.01)，提示：0.01，0.1和1μg/mL浓度本发明药物组合物均具有较好的抗炎活性(见表13，图9B)。

表13：不同浓度本发明药物组合物对293T细胞NF-κB荧光素酶活性的影响(x±SD)(n＝18)

注：***P<0.001vs对照,###P<0.001vs模型,#P<0.05vs模型。

3实验结论

本发明药物组合物无明显的抗氧化作用，0.01-10μg/ml本发明药物组合物明显抑制TNF-α诱导的NF-κB活性，具有显著抗炎活性。

如上已经一般和详细地描述了本发明及其实施方式。本领域技术人员将会理解，根据本申请中所公开的教导，可以对本发明中的细节进行各种修改和替换等改变，这些改变后所得到的技术方案均在本发明的范围之内。