Nanometer antibody targeting CEACAM5 as well as preparation method and application thereof

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请实施例第一方面提供了一种靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体B12，其中，所述纳米抗体B12的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。

本申请实施例第一方面提供的靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体B12，其中，所述纳米抗体B12的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。由于CEACAM5可作为神经发育相关转录因子ASCL1的下游靶基因，而表达于CRPC-NE膜表面。同时，相关研究亦证实CEACAM5基因的表达产物CEA在血清中水平升高，相关于CRPC-NE的内脏转移。因此，CEACAM5可作为潜在治疗靶点，用于CRPC-NE的诊断与治疗；提供的纳米抗体B12与CEACAM5具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5，有利于开发与神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体相关药物，实现对去势抵抗性神经内分泌化阶段前列腺癌进行靶向治疗，具有非常大的临床应用价值。同时纳米抗体由于分子量小，有利于进行广泛应用。

在一些实施例中，靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体B12，其中，所述纳米抗体B12的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，其中，Seq.ID NO.1为：MAVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAASGVTFSTYGMGWARQVPGKGLEWVCGTYSDGSTYCADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCTAPKHEYGTNWYERTIYSNELDYWGQGTQVTVSS。

在一些实施例中，纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。

其中，所述纳米抗体B12中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2为：MAVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAAS。

FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3为WARQVPGKGLEWVC。

FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4为YCADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCT。

FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5为WGQGTQVTVSS。

CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6为GVTFSTYGMG。

CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7为GTYSDGST。

CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.8为APKHEYGTNWYERTIYSNELDY。

在一些实施例中，所述纳米抗体B12的碱基序列如Seq.ID NO.9所示，Seq.IDNO.9为：

ATGGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCAGCCTGGGGAGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGTGTCACCTTCAGTACATATGGGATGGGCTGGGCCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTGTGCGGAACTTATAGTGATGGTAGCACATATTGTGCAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGGTGTATTTGCAAATGACTAGCCTGAAACCTGAAGATACGGCCGTTTATTACTGTACAGCCCCCAAACATGAATACGGGACTAACTGGTACGAGAGGACAATTTACTCGAATGAACTTGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

本申请实施例第二方面提供靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体在制备治疗去势抵抗性神经内分泌化阶段前列腺癌的药物中的应用。

本申请实施例第二方面提供的靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体在制备治疗去势抵抗性神经内分泌化阶段前列腺癌的药物中的应用。由于CEACAM5可作为神经内分泌化前列腺癌的潜在治疗靶点，并且提供的靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体B12对CEACAM5具有高强度的结合能力，因此纳米抗体B12应用于制备治疗去势抵抗性神经内分泌化阶段前列腺癌的药物能够有利于对去势抵抗性神经内分泌化阶段前列腺癌进行针对性治疗，提高治疗靶向性及治疗效果。

在一些实施例中，所述药物包括CAR T相关药物、CAR NK相关药物、双特异性抗体相关药物、纳米药物中的至少一种。

本申请实施例第三方面提供靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体在制备识别去势抵抗性前列腺癌神经内分泌化阶段成像的药物中的应用。

本申请实施例第三方面提供的靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体在制备识别去势抵抗性前列腺癌神经内分泌化阶段成像的药物中的应用，由于靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体B12对CEACAM5具有高强度的结合能力，因此纳米抗体B12应用于制备识别去势抵抗性前列腺癌神经内分泌化阶段成像的药物能够有利于对去势抵抗性前列腺癌进行针对性成像，有利于对去势抵抗性前列腺癌进行分析及治疗。

本申请实施例第四方面提供一种靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：

S01.提供神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5-FC蛋白；

S02.将所述神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5-FC蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；

S03.将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增并进行ELISA验证，再进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；

S04.将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体。

本申请实施例第四方面提供的靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体的制备方法，该制备方法基于噬菌体天然纳米抗体文库进行抗体筛选，得到一条纳米抗体B12，纳米抗体B12与神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5有较高的结合力，该制备方法快速、简便，有利于大量筛选，提高了筛选效率。

步骤S01中，提供神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5-FC蛋白。在一些实施例中，CEACAM5-FC蛋白购买自ACROBiosystems公司。

步骤S02中，将所述神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5-FC蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库。

在一些实施例中，采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2x10⁹。筛选步骤如下：将目的蛋白按50μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；使用第三轮噬菌体洗脱液铺板。

步骤S03中，将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增并进行ELISA验证，再进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列。

在一些实施例中，随机挑取192个单克隆进行ELISA验证。使用第三轮噬菌体洗脱液铺板挑取单克隆做ELISA，以CEACAM5的ELISA读数大于对应BSA读数3倍，且FC抗原的ELISA读数对应BSA读数低于2倍为阳性标准。经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆送公司测序确定序列信息；根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体。

S04.将所述纳米抗体的基因序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体。

在一些实施例中，将纳米抗体基因序列克隆入PET-22B载体，同时融合表达血凝素标签(hemagglutinin HA tag)与HIS TAG用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，由于为周质表达系统，在30℃,250rpm条件下，使用1.0mM浓度的ITPG诱导过夜；b)，离心收集菌体、PBS清洗并使用含有10nM咪唑的磷酸盐溶液重悬菌体；c)，按照每50ml菌液对应50万单位的比例加入多粘菌素，37℃条件下摇床裂菌1小时；d)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；e)，使用梯度咪唑/磷酸盐溶液(10mM和20mM)清洗去除菌体蛋白。15％SDS-PAGE胶电泳分离，考马斯亮蓝染色及蛋白免疫印迹分析鉴定。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

体外验证CEACAM5在CRPC-NE中的表达特征(组织/细胞水平)

试验过程：

1)组织免疫组化染色

CRPC-NE前列腺癌组织来源于南方医科大学第三附属医院，合计4例。收集PDX模型CRPC-NE组织3例。正常人体组织、前列腺癌、良性前列腺增生及正常前列腺组织来源于组织芯片(中科光华)。石蜡包埋组织脱蜡水化进行抗原修复。OCT包埋组织，切片后使用PBS清除OCT并使用丙酮/甲醇溶液(4：1)固定10分钟。所有组织用3％过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶活性。用TBS清洗2～3次后，4％驴血清封闭1小时。之后用封闭液按1：100稀释CEACAM5抗体，与芯片共孵育1小时。再次用TBS清洗2～3次，用封闭液按1：200稀释生物素标记的二抗，与芯片共孵育1小时。TBS清洗2～3次后滴加滴加适量的辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，室温孵育30分钟。TBS冲洗2～3次。DAB显色剂显色2分钟后自来水充分冲洗，脱水，透明，封片。

2)细胞提取蛋白免疫印迹实验

取处于生长对数期的前列腺癌细胞系LNCAP、22RV1、VCAP、PC3及NCI-H660。置于冰上预冷10分钟，PBS清洗3遍并晾干。使用预先加入PMSF、蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA强效裂解液充分裂解上述细胞。12000rpm离心5min后收集上清，并按照1:4加入loading buffer于95℃煮沸5min变形蛋白。取配制好的10％SDS-PAGE胶，电泳分离至蛋白marker充分分离后，将细胞裂解液转印至PVDF膜上。10％脱脂奶粉封闭1小时后，按照1:100稀释CEACAM5抗体并于4℃冰箱内孵育过夜。TBST清洗三遍，孵育二抗并再次以TBST溶液清洗3遍。ECL显影曝光。

3)细胞免疫荧光分析

取22RV1、VCAP(CEACAM5-)及NCI-H660、HT29(CEACAM5+)细胞系植入多聚赖氨酸包被的Perkin Elmer ultra cell 96孔板内。具体步骤如下：a)，将细胞置于冰上，用PBS洗涤3次，0.25％多聚甲醛固定10分钟；b)，用PBS洗涤3次，4％BSA封闭1小时；c)，用封闭液按1：100稀释CEACAM5抗体，室温下与细胞共孵育1小时；d)，预冷PBS洗涤3次，用封闭液按1：1000稀释Alexa 594偶联的二抗，与细胞共孵育1小时；e)，预冷PBS洗涤3次，Hoechst 33342核染，荧光倒置显微镜检测CEACAM5蛋白的表达情况。

4)流式细胞术膜表面抗原检测

取CEACAM5阳性细胞系NCI-H660及HT29。胰酶消化后收集细胞并使用PBS清洗。4％PFA固定10分钟后，再次PBS清洗。按照1:100比例使用4％ BSA溶液稀释CEACAM5抗体并在室温下孵育1小时。PBS清洗3遍后，再次加入1:1000稀释的Alexa 488偶联的二抗并于室温下孵育1小时。充分PBS清洗后上机，FITC通道检测细胞系膜表面抗原特征。

结果分析：

免疫组化分析CEACAM5在前列腺腺癌(按照国际泌尿病理协会前列腺癌病理分级系统，ISUP分级，进行分组处理)、CRPC-NE及正常人体组织中的表达特征。结果如图1所示，其中，图1的A与图1的B为CEACAM5蛋白在CRPC-NE组织中的表达特征及阳性率分析；图1的C与图1的D为CEACAM5在前列腺腺癌组织中表达特征及阳性率分析；图1的E和图1的F为CEACAM5在正常人体组织中的表达特征。可以看出，CRPC-NE组织具有较高的CEACAM5表达阳性率。其在CRPC-NE临床标本及PDX组织的阳性率分别可达50％(2/4)与66％(2/3)。但在前列腺腺癌、前列腺增生及正常组织中，CEACAM5免疫组化染色几乎均呈阴性。同时，正常人体组织的免疫组化示CEACAM5仅在部分消化道组织(食管、结肠)中呈阳性表达，而在胃、小肠、肝、胰腺、肺、肾、膀胱、睾丸、脾及心脏组织中均为阴性表达。综合以上结果，认为CEACAM5是CRPC-NE组织中特异性高表达的膜蛋白标志物。

随后，使用蛋白免疫印迹技术分析CEACAM5在前列腺癌细胞系中的表达特征。结果发现CEACAM5在CRPC-NE来源的NCI-H660细胞系中为阳性表达。后续使用免疫荧光分析，如图2所示，CEACAM5在CRPC-NE细胞系中膜表达特征，其中，图2的A为免疫印迹分析CEACAM5在前列腺癌细胞系中内源性表达；图2的B和图2的C为CEACAM5在CRPC-NE细胞系及CDX模型中的膜表达特征；图2的D为CEACAM5在CRPC-NE来源NCI-H660细胞系中的膜表达阳性率测定。可以发现CEACAM5定位于NCI-H660细胞系胞膜。NCI-H660CDX组织标本免疫组化亦证实CEACAM5的膜表面阳性表达特征。流式细胞术分析示，CEACAM5在CRPC-NE来源细胞系NCI-H660中的阳性率为37.8％。

综上，提示CEACAM5是CRPC-NE重要的膜蛋白标志物，并可作为抗体靶向治疗的潜在靶点。

实施例2

靶向CEACAM纳米抗体噬菌体文库筛选、纯化与鉴定

试验过程：

1)纳米抗体筛选

CEACAM5-FC蛋白购买自ACROBiosystems公司。采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2x109。筛选步骤如下：a)，将目的蛋白按50μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；b)，使用第三轮噬菌体洗脱液铺板，随机挑取192个单克隆进行ELISA验证。使用第三轮噬菌体洗脱液铺板挑取单克隆做ELISA，以CEACAM5的ELISA读数大于对应BSA读数3倍，且FC抗原的ELISA读数对应BSA读数低于2倍为阳性标准。c)，经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆送公司测序确定序列信息；d)，根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体，通过大肠杆菌进行表达纯化；e)，利用ELISA亲和性实验来初步鉴定纳米抗体的亲和力，选择亲和力较好的纳米抗体，表达纯化后进行表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)测定亲和常数。

2)纳米抗体的纯化表达

将纳米抗体基因序列克隆入PET-22B载体，同时融合表达血凝素标签(hemagglutinin HA tag)与HIS TAG用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，由于为周质表达系统，在30℃,250rpm条件下，使用1.0mM浓度的ITPG诱导过夜；b)，离心收集菌体、PBS清洗并使用含有10nM咪唑的磷酸盐溶液重悬菌体；c)，按照每50ml菌液对应50万单位的比例加入多粘菌素，37℃条件下摇床裂菌1小时；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，使用梯度咪唑/磷酸盐溶液(10mM和20mM)清洗去除菌体蛋白。15％ SDS-PAGE胶电泳分离，考马斯亮蓝染色及蛋白免疫印迹分析鉴定。

结果分析：

如图3所示，图3的A为通过3轮噬菌体纳米抗体文库筛选，文库富集度超过50倍。随后，从第三轮所得文库中挑选192个克隆进行二次噬菌体ELISA初步验证，获得阳性克隆1个，命名为纳米抗体B12(如图3的B所示)，具体的氨基酸序列为：

MAVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAASGVTFSTYGMGWARQVPGKGLEW VCGTYSDGSTYCADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCTAPK HEYGTNWYERTIYSNELDYWGQGTQVTVSS。

进一步，根据B12序列优化密码子后，导入PET.22B载体并在大肠杆菌中进行诱导表达。多粘菌素裂菌后，Ni柱捕获带有His标记蛋白的B12纳米抗体。梯度咪唑/磷酸盐溶液(10mM和20mM)清洗去除菌体蛋白。如图4所示，获得高纯度纳米抗体B12。其中，图4的A为纯化所得纳米抗体B12考马斯蓝染色结果，图4的B为使用蛋白免疫印迹方式验证纳米抗体所带HIS及HA tag的分析结果，确定纯化所得为纳米抗体B12。

实施例3

B12纳米抗体靶向CEACAM5抗原的体外实验研究

试验过程：

1)斑点印迹实验

使用含有PMSF、蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA强效裂解液提取CEACAM5阳性细胞HT29及NCI-H660总蛋白，BCA定量。取硝酸纤维膜，使用铅笔画出1cm3小格。按照0、0.4、0.8、1.2、1.6及2.0μg梯度配制5μL待检溶液并滴入小格内。室温晾干。10％脱脂奶粉封闭1小时后，使用4％ BSA按照20μg/ml浓度配制纳米抗体工作液15ml。将纳米抗体工作液与硝酸纤维膜置入10cm皿内，4℃孵育过夜。PBST清洗3遍，按照1:1000比例加入与辣根过氧化物偶联的anti-HA抗体室温孵育1小时。再次PBST清洗。ECL显影曝光。

2)纳米抗体的ELISA实验

ELISA板包被CEACAM5-FC蛋白。同时，包被FC抗原与BSA作为阴性参照。4％BSA封闭，之后加入各种浓度的纳米抗体在室温孵育1小时，PBS漂洗3次，anti-HA抗体室温孵育1小时后，辣根过氧化物酶标记的抗HA抗体放大信号，TMB显色。

3)表面等离子共振实验

此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用，并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体被被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。

结果分析：

通过Dot blot实验，结果如图5所示，其中，图5的A为Dot blot实验分析纳米抗体可识别CEACAM5阳性细胞系(NCI-H660及HT29)裂解液中的CEACAM5抗原。发现纯化所得纳米抗体B12可有效识别CEACAM5阳性细胞裂解液中CEACAM5抗原。其表现为斑点信号强度与细胞裂解液蛋白量间的线性关联。

图5的B为Elisa实验确认纳米抗体B12识别CEACAM5抗原的亲和力及特异性。Elisa亦证实纳米抗体B12在识别CEACAM5抗原的过程中，具有高度的特异性及亲和力。

图5的C为SPR实验证实纳米抗体B12识别CEACAM5抗原效价处于纳摩尔水平(KD＝6.653*10^-8M)。SPR实验确证B12纳米抗体识别CEACAM5抗原效价处于纳摩尔水平(KD＝6.653*10^-8M)。综上，纳米抗体B12可有效识别CEACAM5抗原。

实施例4

B12纳米抗体靶向CEACAM5阳性细胞系的体外结合研究

试验过程：

1)纳米抗体CEACAM5+细胞系的免疫荧光分析

复苏CEACAM5阳性的HT29及NCI-H660细胞，传代3次后将细胞接种在96孔板中用于后续实验。具体步骤如下：a)，PBS洗涤3次，0.25％多聚甲醛固定10分钟；b)，用PBS洗涤3次，4％BSA封闭1小时；c)，用封闭液将纳米抗体稀释为1μM的工作液并与细胞在室温下孵育1小时；d)，PBST洗涤3次，加入1:100稀释的anti-HA抗体室温孵育1小时；e)，PBST洗涤3次，加入用封闭液按1：1000稀释的Alexa 594偶联二抗，与细胞共孵育1小时；f)，PBST清除残余抗体，Hoechst33342核染，倒置荧光显微镜下观察。

2)Cell Elisa

将纳米抗体与IR800-Mal按照5：1的投料比，4℃条件下反应过夜。之后进行SDS-PAGE凝胶分析纯度，并于荧光模式下检测蛋白的标记效果。如4％多聚甲醛固定种植于96孔板中EACAM5阳性的HT29及NCI-H660细胞。4％BSA封闭1小时。用封闭液将纳米抗体稀释为梯度工作液(最高750nM)。并与细胞在室温下孵育1小时。PBST洗涤3次。全自动电泳荧光免疫分析仪检测细胞表面纳米抗体的结合情况。

结果分析：

如图6所示，免疫荧光示，相比于阴性对照纳米抗体C9，纳米抗体B12可有效定位于CEACAM5阳性的CRPC-NE细胞系NCI-H660细胞膜上。Cell Elisa实验进一步显示，纳米抗体B12对CEACAM5阳性细胞系HT29及NCI-H660均有高度的识别效能。

综上，本申请提供的靶向神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体B12，其中，所述纳米抗体B12的氨基酸序列如Seq.IDNO.1所示。由于CEACAM5可作为神经发育相关转录因子ASCL1的下游靶基因，而表达于CRPC-NE膜表面。同时，相关研究亦证实CEACAM5基因的表达产物CEA在血清中水平升高，相关于CRPC-NE的内脏转移。因此，CEACAM5可作为潜在治疗靶点，用于CRPC-NE的诊断与治疗；提供的纳米抗体B12与CEACAM5具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5，有利于开发与神经内分泌化前列腺癌特异性膜标志物CEACAM5的纳米抗体相关药物，实现对去势抵抗性神经内分泌化阶段前列腺癌进行靶向治疗，具有非常大的临床应用价值。同时纳米抗体由于分子量小，有利于进行广泛应用。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。