INGENANE-TYPE DITERPENE COMPOUND, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING VIRAL INFECTIOUS DISEASES CONTAINING SAME

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

일반적인 실험 과정

용융점은 코플러 마이크로-호스테이지(Kofler micro-hostage) 상에서 측정되었다. 광학적 회전은 Jasco P-1020 편광계로 측정하였다. UV 데이터는 UV-VIS 분광기 2400 상에서 얻었으며, FT-IR 스펙트럼은 Jasco FT/IR-4200을 이용하여 얻었다. NMR 스펙트럼은 내부 표준물질로서 테트라메틸실란을 사용하여 Varian UNITY 400 및 Brucker DMX-800 MHz FT-NMR 분광기 상에서 기록하였다. HRESIMS 및 HRFABMS는 Waters Q-Tof Premier 분광기 및 JEOL JMS-HX110 분광기 상에서 각각 수행하였다. HPLC 분리는 UV/VIS-155 검출기를 사용하여 Gilson pump 305 상에서 수행하였다.

식물 재료

감수(Euphorbia kansui)의 뿌리는 중국 수입산으로 국내 생약 판매회사인 칠성사로부터 구입하였으며 표준품(PB-3755)는 한국생명공학연구원의 추출물은행에 보관하고 있다.

세포 배양

NK92 세포(인간 NK 림프종)를 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. NK92 세포를 20% 우태아 혈청(Invitrogen), 2 mM L-글루타메이트, 100 mg/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 α-MEM (Invitrogen, 미국) 중에서 유지시킨 다음, 100 U/mL IL-2 (Peprotech, 미국)로 보충하였다. NK92 세포 배양을 5% CO₂ 습도 대기로 37 ℃ 배양기 내에서 수행하였다. 인간 IFN-γ의 양을 분석 키트(Endogen, Woburn, 미국)를 이용하여 공급자의 프로토콜에 따라 분석하였다.

실시예 2: 추출 및 분리

상기 실시예 1의 MeOH 추출물(1 kg)을 H₂O 중에 현탁시키고 CHCl₃, EtOAc, 및 n-BuOH로 연속적으로 분배시켜 230.0 g의 CHCl₃-가용성 추출물, 4.5 g의 EtOAc-가용성 추출물, 및 41.0 g의 n-BuOH-가용성 추출물을 얻었다. CHCl₃-가용성 분획이 IFN-γ 생산에 가장 활성이 높은 것으로 확인되었다. 상기 CHCl₃-가용성 분획(100 g)을 n-헥산:EtOAC (50:1 내지 1:1 v/v)의 단계적인 농도구배 혼합물을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시한 다음, CHCl₃:MeOH (5:1 내지 1:1 v/v)의 단계적인 농도구배 혼합물을 사용하여 다시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 22개 분획물(KC16-1 - KC16-22)을 얻었다. 그 다음 분획 KC16-7 내 물질을 결정화하여 화합물 9 (10 g)를 얻었다. 분획 KC16-12 (5.7 g)를 MeOH:H₂O (4:1 내지 4.5:1, 그 다음 100% MeOH)로 용리되는 중압액체 크로마토그래피 시스템(MPLC)으로 RP C-18 (3.5 × 40 cm, 40C₁₈-PREP) 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 20개의 분획(KC16-12-1 - KC16-12-20)을 얻었다. 분획 KC16-12-18 (485 mg)을 H₂O 중의 90% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 3개의 분획(KC16-12-18-1 - KC16-12-18-3)을 얻었다. 분획 KC16-12-18-2 (198 mg)를 역상 컬럼을 이용한 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 ㎛, 100% MeOH, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 1 (10.0 mg, t_R 13.2 min) 및 2 (60.0 mg, t_R 17.1 min)를 얻었다. 분획 KC16-12-20 (777 mg)을 n-헥산:EtOAC (5:1 내지 1:1 v/v)로 용리되는 실리카 겔 MPLC 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 8개의 분획(KC16-12-20-1 - KC16-12-20-8)을 얻었다. 분획 KC16-12-20-1 (366 mg)을 H₂O 중의 90% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 통해 분획하여 4개의 분획(KC16-12-20-1-1 - KC16-12-20-1-4)을 얻었다. 분획 KC16-12-20-1-2 (100 mg)를 역상 컬럼을 이용한 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 100% MeOH, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 7 (4 mg, t_R 62.1 min)을 얻었다. 활성 분획 KC16-14 (2.8 g)를 MeOH:H₂O (1:1 내지 4.5:1, 그 다음 100% MeOH)로 용리되는 RP C-18 컬럼 (3.5 × 40 cm, 40C₁₈-PREP) 상에서 MPLC를 통해 크로마토그래피하여 18개의 분획(KC16-14-1 - KC16-14-18)을 얻었다. 분획 KC16-14-10 (153 mg)을 n-헥산:EtOAC로 용리되는 MPLC 컬럼 크로마토그래피(3:1 v/v, 3.5 ×40 cm)를 통해 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 4개의 분획(KC16-14-10-1 - KC16-14-10-4)을 얻었다. 분획 KC16-14-10-1 (36 mg)을 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 88% MeOH in H₂O, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 4 (9 mg, t_R 23.5 min) 및 5 (4 mg, t_R 32.6 min)를 얻었다.

분획 KC16-14-12 (295 mg)를 H₂O 중의 80% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 5개의 분획(KC16-14-12-1 - KC16-14-12-5)을 얻었다. 분획 KC16-14-12-2 (150 mg)를 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 83% MeOH in H₂O, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 3 (40 mg, t_R 31.3 min)을 얻었다.

분획 KC16-14-15 (144 mg)를 H₂O 중의 80% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 6개의 분획(KC16-14-15-1 - KC16-14-15-6)을 얻었다. 분획 KC16-14-15-6 (55 mg)을 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC(YMC 250 x 20 mm, 4 mm, 70% MeCN in H₂O, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 8 (25 mg, t_R 15.4 min)을 얻었다.

분획 KC16-21 (1.2 g)을 n-헥산:EtOAC (5:1 내지 1:1 v/v, 3.5 × 40 cm)로 용리되는 MPLC 컬럼 크로마토그래피를 통해 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 18개의 분획(KC16-21-1 - KC16-21-18)을 얻었다. 분획 KC16-21-8 (242 mg)을 n-헥산-디메틸 클로라이드-MeOH (10:10:1 v/v, 2.5 × 170 cm)로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 6개의 분획(KC16-21-8-1 - KC16-21-8-6)을 얻었다. 하위 분획 KC16-21-8-3 (130 mg)을 H₂O 중의 90% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 8개의 분획(KC16-21-8-3-1 - KC16-21-8-3-8)을 얻었다. 분획 KC16-21-8-3-8 (40 mg)을 역상 컬럼을 이용하년 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 100% MeOH, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 6 (4.5 mg, t_R 12.6 min)을 얻었다.

실시예 3: 화합물 1의 R- 및 S-MTPA 에스테르 유도체의 제조

화합물 1 (2.0 mg)을 2 mL 무수 CH₂Cl₂ 중에 용해시켰다. (S)-(+)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸 클로라이드(3 mL) 및 N,N-디메틸-4-아미노피리딘을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 24 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완결된 후, 상기 잔사물에 대해 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피[1 × 7 cm, n-헥산:EtOAc (15:1)]를 수행하여 R-MTPA 유도체를 얻었다.

S-MTPA 유도체는 다른 입체이성질체로 대체한 것을 제외하고는 상기와 동일한 과정을 이용하여 제조하였다.

실시예 4: 화합물 동정

화합물 1은 무색의 검(colorless gum)으로서 얻어졌다. 이의 IR 스펙트럼은 히드록실 작용기(3446 cm^-1) 및 카보닐 작용기(1732 cm^-1)의 존재로 인한 흡수 밴드를 나타내었다(도 1). 화합물 1의 고해상도 FABMS는 분자식 C₃₈H₆₀O₇에 해당하는, m/z 651.4271에서의 [M+Na]⁺ 피크를 나타내었다(도 2). 또한, 화합물 1의 HRFABMS(포지티브)는 모분자로부터 각각 2,3-디메틸부타노에이트 및 도데카노에이트 단위의 손실을 나타내는, m/z 513 [M+H-116]⁺ 및 429 [M+H-200]⁺에서의 2개의 특징적인 이온 단편 피크를 나타내었다(도 3 및 도 4). 화합물 1의¹H-NMR 분광학적 데이터(도 5)는 δ_H 2.38 (1H, m), 2.0 (1H, m), 1.14 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.98 (3H, d, J = 4.8 Hz), 및 0.94 (3H, d, J = 6.5 Hz) ppm에서 2,3-디메틸부타노에이트기에 속하는 프로톤 시그널을 나타내었다. 도데카노에이트 스펙트럼은 δ_H 2.19 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.57 (2H, m), 1.25 [오버랩 시그널, 16H], 및 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz)에서 시그널을 나타내었다. δ_H 1.83, 1.64, 1.24, 1.07, 및 0.99에서의 5개의 메틸기, δ_H 2.76 및 2.15에서의 하나의 메틸렌기, δ_H 5.88, 5.85, 4.18, 2.52, 및 1.25에서의 7개의 메틴기(2개의 올레핀 포함), 및 δ_H 5.24 및 3.81에서의 2개의 산소화된 메틴기로 이루어지는 나머지 프로톤 시그널들은 인제놀-타입 구조 부분인 것으로 분석되었다. 이러한 분석은¹³C-NMR(도 6) 및 HMQC(도 7) 분광학적 데이터의 해석을 통해 추가로 뒷받침되었다. 수집된 데이터에 기초하여, 화합물 1은 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀(2)과 일부 유사성이 있음을 알 수 있었다. 상기 두 화합물의 주요 차이점은 2,3-디메틸부탄산 부분의 위치인 것으로 나타났다. 화합물 1의 2,3-디메틸부타노일기의 위치는 H-5 (δ_H 5.24) 및 C-1' (δ_C 176.1) 사이의 HMBC 상관관계에 의해 C-5에 존재하는 것으로 확인되었다(도 8).

또한, 화합물 1의 구조에서 C-3의 절대 배열을 결정하기 위하여 상기 실시예 3과 같이 모셔(Mosher) 유도체(1R 및 1S)를 제조하였다. 도 9에서 보여주듯이, 차이(Δδ_S-R)가 관찰되었으며, H-1 및 H-19의 포지티브 값과 H-5, H-7, 및 H-20의 네거티브 값이 C-3에서의 절대 배열이 S인 것으로 명백하게 입증하였다. 따라서, 화합물 1의 구조는 (3S)-5-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀인 것으로 확인되었다.

화합물 1의 절대 입체화학을 확인하기 위한 추가적인 실험을 NOESY를 이용하여 수행하였다. NOE 스펙트럼은 H-5, H-20, H-8, H-17, 및 H-11 사이의 상관관계를 보였으며, 이는 H-5가 β-배향인 것을 나타낸다. 따라서, 5-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀(1)은 (3S, 5R, 16R, 17S, 18R, 19S, 20R)인 것으로 확인되었다(도 10).

동일한 클로로포름 추출물로부터 분리된 8개의 추가 화합물들은 이들의 공개된 분광학적 데이터와의 비교에 근거하여, 각각 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀(2), 20-O-데카노일인제놀(3), 20-O-아세틸인제놀-3-O-(2'E,4'Z) 데카디에노에이트(4), 간수이포린 A (5), 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일인제놀(6), 간수이닌 F(7), (20R,23E)-이우파-8,23-디엔-3b,25-디올(8), 및 이우폴(9)인 것으로 확인되었다.

화합물 1의 물리화학적 특징 및 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다: 무색 검 (CHCl₃);²⁶_D-30°(c 0.1, CHCl₃); UV (EtOH) λ_max nm (log ε) 210 (3.91), 282 (3.08); IR (박막) cm^-1: 3346, 1732. FABMS m/z 651 [M+Na]⁺, 629 [M+H]⁺, 513 [M+H-116]⁺,^{429 [M+H-200]+, HRFABMS m/z 651.4271 [M+Na] (calcd for C₃₈H₆₀O₇Na, 651.4237).}

아울러,¹H-NMR (CDCl₃) 및¹³C-NMR (CDCl₃) 데이터를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

실시예 5: 본 발명 화합물들의 IFN-γ 생산 능력 및 세포 독성 조사

IFN-γ의 검출을 위하여, 2 × 10⁵ NK92 세포/mL를 48-웰 배양 플레이트에 접종하고, 20% FBS 및 IL-2를 함유하는 α-MEM 배지 중에서 상기 각각의 분리된 화합물과 함께 12 시간 동안 배양시켰다. 배양 상등액 중에 분비된 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더 상에서 측정하고 모든 화합물 처리 분석은 2회 반복으로 수행하였다. 화합물-처리된 NK92 세포의 세포 독성은 MTT 분석을 통해 평가하였다.

그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 보여주듯이, 화합물 1-6 및 8만이 NK92 세포에서 IFN-γ 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, IFN-γ 생산에 대한 각 화합물의 유효 투여량은 매우 다양하였다. 10 nM의 화합물 4 및 6이 동일한 투여량의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)와 유사하게 IFN-γ 생산에 대한 유의적인 효과를 가지는 것으로 나타났다. 화합물 3 (100 nM), 1 (1.25 μM), 5 및 8 (각각 5 μM) 역시 NK92 세포 상에 처리되었을 때 IFN-γ 생산활성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 본 발명에서 감수(Euphorbia kansui)의 뿌리로부터 분리한 인제난 타입의 디테르펜 화합물들이 IFN-γ 유도제로써 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.