COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING COLON CANCER, CONTAINING 3,6-ANHYDRO-L-GALACTOSE
본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 대장암 세포의 세포사멸 유도 및 세포증식 억제능을 통해 대장암을 예방, 개선, 또는 치료하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 대장암(colon cancer)은 미국에서 암과 관련된 사망의 주된 요인일 뿐 아니라, 2010년 미국에서 약 102,900명이 대장암으로 진단되고, 51,370명이 사망할 것으로 추정되는 암이다. 최근에는 서구화된 식습관으로 인해 아시아에서도 그 발병률이 증가하고 있는 추세이며, 관련된 요인으로는 과도한 동물성 지방, 당분, 알코올 섭취와 섬유소, 항산화 비타민, 야채나 과일의 섭취 부족 등이 주요 원인으로 알려져 있다. 특히 동물성 지방과 육류를 많이 섭취하면 채소나 곡물 등의 섬유질 식품 섭취와는 달리 대변 양이 적고 내용물이 대장을 통과하여 배설되는 시간이 많이 걸린다. 또한 담즙산과 스테롤의 배설이 증가하며 대장 내에 존재하는 세균종의 구성에도 변화를 일으켜 이들 물질을 화학적으로 변화시키는 세균의 종류가 증가한다. 따라서 발암물질이 많이 생성되고 발암물질이 대장 내에 머물고 접촉하는 시간도 길어져서 대장암이 많이 발생하게 된다. 대장암의 경우 혈관을 중심으로 많은 수의 세포들이 서로 덩어리진 형태로 성장하는 대표적인 고형암 세포로서 치료방법이 극히 제한적으로 완치가 어려운 암 중 하나이다. 즉, 덩어리진 대장암 세포의 중심부까지 약물이 제대로 투과하지 못하기 때문에 대장암 세포를 완전히 제거하기란 쉬운 일이 아니다. 현재 약물로써 대장암을 치료할 수 있는 방법은 거의 없는 실정이고, 수술요법이나 방사선요법 등과 같은 외과적인 치료만이 대장암을 치료하는 제한적인 방법이며, 또한 이러한 치료법으로는 대장암의 완치가 어렵다. 따라서 많은 연구자들이 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발함으로써 대장암 세포뿐만 아니라 대부분의 암세포들의 성장을 효과적으로 억제시키기 위해서 많은 연구를 수행하고 있다. 세포사멸(apoptosis)은 대부분의 항암제가 암세포의 증식억제 효과를 나타내는 중요한 작용기작으로, 세포 내부에 프로그램된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음이다. 세포사멸은 생명체의 여러 정상적인 생리적 현상에서 쉽게 관찰된다. 예를 들면 세포사멸은 생명체의 초기 발생단계에서 관찰되는 여러 형태적 변화과정과 면역계 또는 신경계의 기능적 자가 조직화과정에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, 성인이 된 이후에도 조직 항상성 세포 수의 조절, 손상된 세포의 제거, 감염에 대한 방어 기작으로서 필수적으로 작용한다. 세포사멸은 여러 질환들의 발병과정에도 깊이 관여하는데 비정상적인 세포사멸의 발생은 퇴행성뇌신경질환, 면역계 이상, 그리고 심장 혈관계질환 등의 원인이 될 수 있으며, 세포사멸의 비정상적인 억제는 암의 원인이 될 수 있다. 세포사멸이 정상적인 조절과정에서 벗어나 비정상적으로 발행하거나 억제되어 나타나는 질병을 좀 더 자세히 살펴보면, p53, p16와 Bcl-2 등의 유전자의 이상 발현에 의해 유도되는 암들, HIV, Herpes 및 독감 바이러스들은 여러 감염증, 그리고 당뇨, 류마티스 관절염, 다발성 경화증과 근무력 등과 같은 자가면역 질환들이 있다. 이와 같이, 세포사멸은 생명체의 다양한 생리작용을 정상적으로 유지하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 여러 질병들의 발병과정에도 밀접한 관련이 있다. 개체를 구성하는 각 세포의 세포사멸은 유전적으로 손상을 입은 세포나 분화 자극제에 의해 부적절한 분화의 유도에 의한 종양의 발달을 막기 위해 이들 비정상적인 세포를 개체에서 제거하기 여러 수단, 즉 회복 불가능한 유전적 상처를 지닌 세포들을 개체에서 제거하기 위한 일반적인 수단이다. 이 개념은 일반적으로 사용되는 항암제가 암세포의 증식억제와 연관된 세포사멸 과정을 통해 암세포의 사멸을 유도한다는 사실에 의해 뒷받침되고 있다. 따라서 세포사멸 과정의 교란은 손상되거나 손상이 시작된 세포의 생존과 그들 세포의 성장을 유도하기 때문에 세포사멸의 억제는 암화과정에서 중요한 역할을 한다. 아울러 암 예방 효과가 있는 물질들은 이러한 비정상적인 세포의 세포사멸을 유도하며, 이들에 의한 세포사멸의 유발은 최소한 그들의 암 예방 활성과 연관되어 있음이 보고되었다. 이에, 본 발명자들은 상기 홍조류 유래 한천으로부터 분리·정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 암세포의 세포사멸을 유도하며 암세포의 증식을 억제하는데 탁월한 효과를 나타냄을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 목적은 대장암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다: [화학식 1] 본 발명은 또한 상기 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 대장암 치료에 사용하는 상기 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제공한다. 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 대장암 세포의 생장을 억제하고, 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 우수한 항암 활성을 나타내므로 대장암 예방, 치료, 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다. 도 1은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 대장암 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것이다. 도 2는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 종양 전환 억제 효과를 나타낸 것으로, 사진도는 농도별 L-AHG 처리에 따른 대장암 세포의 콜로니 형성을 육안으로 관찰한 것이며, 그래프는 상기에서 형성된 콜리니의 수를 카운팅 하여 나타낸 것이다. 도 3은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 발생 효과를 나타낸 것으로, 유세포 분석기를 이용하여 sub-G1기, G0/G1기, S기 및 G2/M기의 세포수를 측정한 것이다. 도 4는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 발생 효과를 나타낸 DAPI 분석 결과이다. 도 5는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 세포사멸 관련 단백질, procaspase-3, procaspase-9, caspase-3, caspase-9, PARP, cleaved PARP, Bcl-2, Bcl-xL 및 Bax의 발현에 미치는 효과를 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다. 도 6은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 세포사멸 관련 단백질, p-p38, p38, p-JNK, JNK 및 p53의 발현에 미치는 효과를 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다. 이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다. 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다: [화학식 1] 또한, 본 발명은 대장암 치료에 사용하는 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제공한다. 본 발명자들은 항암 효과가 있는 생리활성물질을 탐색하는 과정에서 홍조류 유래의 한천(agar)을 구성하고 있는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(L-AHG)에 주목하게 되었다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리하지 않은 대조군 대비 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리한 대장암 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였고, 암세포의 종양전환을 농도 의존적으로 억제하였고, 특히 100㎍/mL의 농도에서 탁월한 콜로니 형성 억제 효과를 나타내었다. 또한, 세포주기의 sub-G1기에 해당하는 세포를 증가시키는 것을 확인할 수 있었고, 특히 100㎍/mL의 고농도에서 뚜렷한 세포사멸 발생을 유도하였고, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리한 대장암 세포에서 세포사멸에 전형적으로 보이는 아폽토시스 바디(apoptosis bodies)가 나타났다. 아울러, 세포사멸에 중요한 역할을 하는 효소인 caspase-3, caspase-9(활성형)의 발현은 증가하고, 이들 전구체인 procaspase-3, procaspase-9의 발현은 감소하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 손상된 DNA 복구 관련 단백질인 PARP의 분해를 증가시켰으며, 세포사멸 유발 단백질인 Bax의 발현은 증가시키고 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리 시 세포사멸에 중요한 역할을 하는 p38, JNK의 활성이 증가되고, p53 단백질의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 이와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리로 세포주기가 멈추게 되어 세포 증식 억제 및 사멸이 일어나므로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 대장암 세포의 세포사멸을 유도하며, 암세포의 세포증식을 억제함으로써 대장암의 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 대장암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 사용할 수 있다. 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 바이오매스를 구성하는 대표적인 탄수화물 성분인 한천의 구성 단당으로, 화학적 합성을 통해 얻은 것을 사용하거나, 전처리 된 아가로오스에서 아가로올리고당을 제조하고, 상기 아가로올리고당은 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소에 의한 효소적 당화 공정을 통해 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해되며, 상기 효소적 당화 공정을 통해 얻은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 흡착크로마트그래피인 실리카젤 크로마토그래피와 바이오젤 P2 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 방법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 효소적 당화 공정을 통해 분리 정제 하는 일 구현예로, 상기 전처리는 약산을 이용한 아가로오스의 가수분해일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 또는 옥살산(Oxalic acid) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 상기 약산은 생산단가 및 약산 중화 후 생성되는 염의 분리를 고려하여 0.5 내지 60%(w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로 20 내지 40% (w/v)의 농도로 사용할 수 있다. 상기 아가로오스 및 약산의 반응은 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 실시할 수 있다. 상기 범위 내일 경우 약산에 의한 아가로오스의 과분해산물을 최소화할 수 있다. 상기에서 전처리 후 생성된 아가로올리고당을 이당체를 생산하는 엑소-타입의 아가로오스 분해효소와 반응시켜 네오아가로바이오스를 생산하며, 네오아가로바이오스 가수분해효소와의 추가 반응을 통해 단당체인 갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산한다. 상기 효소 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다. 상기 효소 반응을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 우선, 아가로올리고당을 분해하여 이당체인 네오아가로바이오스를 생산하는 아가로오스 분해효소는 아가로오스의 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소(이하, 'Aga50D'라 함)를 사용할 수 있다. 상기 아가로오스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스( 상기 아가로올리고당 및 아가로오스 분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일간 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다. 상기 효소 반응을 통해 생산된 네오아가로바이오스는 네오아가로바이오스 가수분해효소에 의해 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해된다. 상기 네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스( 상기 네오아가로바이오스와 네오아가로바이오스 가수분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다. 상기 네오아가로바이오스의 분해 산물에 대해 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피인 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 대략 96%의 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 분리 정제할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 한 양태로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화 될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여 할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 식염수 또는 완충용액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 성인에게 1일에 0.1 내지 1000 mg/㎏의 양을, 바람직하게는 10 내지 100 mg/㎏의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 식품용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 것으로 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 우수한 대장암 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다. 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 더 구체적으로 0.0001 내지 10 중량%로 첨가된다. 보다 구체적으로, 0.001 내지 1 중량%로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있을 수 있다. 본 발명의 식품 조성물을 건강음료로 사용하는 경우, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 슈크로오스와 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류; 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01 ∼ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. <실시예 1> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 대장암 세포 증식 억제 효과 측정 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 세포 생존율을 측정하기 위해 엠티티 분석 (MTT assay)을 수행하였다. 사람 유래의 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 96-웰 플레이트에 3×104 cells/mL로 100㎕씩 분주한 다음 37℃, CO2 incubator 에서 4시간 동안 안정화시켰다. 배양된 세포에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 농도별로 조제하여 100㎕씩 첨가한 후 동일한 조건으로 3일간 배양하였다. 여기에 5mg/mL의 농도로 제조한 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 시약을 20㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2, 암조건 하에서 2 시간 동안 배양한 후 포마잔 (formazan) 형성을 관찰하였다. MTT 시약을 제거하고 DMSO를 200㎕ 첨가하여 생성된 포마잔을 용해시킨 후 Microplate (ELISA) reader를 이용하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리군의 세포 생존율을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리하지 않은 대조군 대비 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리한 대장암 세포의 증식이 농도 의존적으로 억제되었다. <실시예 2> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 종양전환 억제 효과 측정 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 종양전환 억제 효과를 측정하기 위해서 소프트 아가 분석(soft agar assay)을 수행하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 암세포의 콜로니 형성에 미치는 영향을 평가하기 위해 사람 유래의 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 10, 50, 100㎍/mL의 L-AHG와 함께 6-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하여 37℃에서 이주일 동안 배양하였다. 이주일 후 현미경을 이용하여 콜로니 형성 정도를 사진으로 찍은 뒤 형성된 콜리니의 수를 카운팅 하여 나타내었다. 콜로니의 수는 다음과 같은 공식으로 계산하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 암세포의 종양전환을 농도 의존적으로 억제하였고, 특히 100㎍/mL의 농도에서 탁월한 콜로니 형성 억제 효과를 나타내었다. <실시예 3> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 발생 효과 측정 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 암세포의 세포사멸 유발 정도를 정량적으로 알아보기 위해서, 세포주기의 sub-G1기에 해당하는 세포, 즉 세포사멸 수의 정도를 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI, SIGMA, MO, USA)염색을 통한 유세포 분석기를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 구체적으로, 사람 유래 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 60 mm 디쉬에 씨딩하고 FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 25, 50, 100㎍/mL의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유한 배지로 교체하였고 동일한 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 찰 때까지 배양하였다. 총 4일간 배양한 후 PI를 이용하여 암세포의 DNA를 염색하였다. 이를 위해 트립신(trypsin)을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 회수하고 원심분리하여 상층액은 제거하고 차가운 인산 완충용액(PBS)으로 1회 세척한 후 70% 무수 에탄올(absolute ethanol)을 1mL 넣어 -20℃에서 24시간 이상 고정시켰다. 원심분리 후 무수 에탄올은 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 20㎍/mL RNase 및 200㎍/mL 프로피디움 요오드(propidium iodide)를 포함하는 1mL의 PBS 내에서 재현탁하였고, 37℃ 암조건에서 10분간 반응시킨 후, 유세포분석기를 사용하여 분석하였다. 각 데이터 파일에 대해 20,000 세포로부터 얻은 데이터를 수집하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 세포주기의 sub-G1기에 해당하는 세포를 증가시키는 것을 확인할 수 있었고, 특히 100㎍/mL의 고농도에서 뚜렷한 세포사멸 발생을 유도하였다. 상기 결과로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 세포주기 진행을 차단하면서 세포사멸을 유도시킨다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 도 4의 DAPI 분석 결과에서 알 수 있듯이 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 대장암 세포에 처리 시 세포사멸에 전형적으로 보이는 아폽토시스 바디(apoptosis bodies)가 나타남을 확인하였다. <실시예 4> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 세포사멸 관련 단백질의 발현 측정 상기 실시예의 결과를 통해서 확인된 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 HCT-116 세포의 세포사멸 유발 기작을 알아보기 위하여 웨스턴 블랏팅(western blotting) 방법을 수행하였고, 세포사멸 유발 조절에 중요한 유전자들의 발현 변화를 확인하였다. Bcl-2는 암 유전자 단백질이지만 다른 암유전자 단백질과는 달리 세포증식에 관여하지 않고 세포생존 조절, 즉 세포사멸을 억제하는 기능이 있으며, Bax는 Bcl-2 패밀리에 속하는 단백질로서, 세포사멸을 촉진시키는 기능이 있다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 관련 단백질의 발현을 측정하기 위해 사람 유래 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 60 mm 디쉬에 씨딩하고 FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 25, 50, 100㎍/mL의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유한 배지로 교체하였고 동일한 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 찰 때까지 배양하였다. 총 5일간 배양한 후 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 이를 위해 PBS로 2번 세척한 후, 세포용해액(lysis buffer)을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 회수하여 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 각각의 상층액을 취한 후 각 세포의 상층액의 단백질 농도를 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 단백질 분석 키트(protein assay kit, BIO-RAD, USA)로 그 사용방법에 따라 정량하였다. 이렇게 만들어진 각각의 단백질(20∼40㎍)을 10% 겔 SDS(gel sodium dodecyl sulphate)-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하여 PVDF 막(membrane)에 100 mA로 2 시간 동안 전이시켰다. 그 후 5% 스킴 밀크(skim milk)를 함유한 TBS-T 용액에 담궈 2 시간 동안 반응시켜 비특이적인 단백질들에 대한 블록킹(blocking)을 실시하고 TBS-T로 1회 세척하였다. 이때, 각 세포의 procaspase-3와 caspase-3의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbi polyclonal anti-human caspase-3 Ab(Cell signaling, USA), procaspase-9과 caspase-9의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human caspase-9 Ab(Cell signaling, USA), PARP와 cleaved PARP의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human PARP Ab(Cell signaling, USA), Bcl-2의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bcl-2 Ab(Cell signaling, USA), Bcl-xL의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bcl-xL Ab(Cell signaling, USA), Bax의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bax Ab(Cell signaling, USA), p-p38의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-human phospho-p38 Ab(BD Biosciences, USA), p38의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-p38 Ab(Santacruz, USA), p-JNK의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human phospho-SAPK/JNK Ab(Cell signaling, USA), JNK의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human JNK(Santacruz, USA), p53의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit monoclonal anti-human p53 Ab(Cell signaling, USA)를 TBS-T 용액에서 1:1000 으로 희석하여 사용하였으며, 반응은 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 HRP가 결합된 anti-rabbit IgG(Santacruz, USA)와 anti-mouse IgG(Santacruz, USA)를 1:5000으로 희석하여 이용하였으며, 반응은 상온에서 2 시간 동안 진행하였다. 그 후 다시 TBS-T로 4 회 세척하여 ECL 기질(AmershamTM, UK)과 1∼3분 동안 반응 시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각 세포의 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 세포사멸에 중요한 역할을 하는 효소인 caspase-3, caspase-9(활성형)의 발현은 증가하고, 이들 전구체인 procaspase-3, procaspase-9의 발현은 감소하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 손상된 DNA 복구 관련 단백질인 PARP의 분해를 증가시켰으며, 세포사멸 유발 단백질인 Bax의 발현은 증가시키고 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리 시 세포사멸에 중요한 역할을 하는 p38, JNK의 활성이 증가되고, p53 단백질의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 세포주기가 멈추게 되어 세포 증식 억제 및 사멸이 일어남을 알 수 있었다. 본 발명에 따른 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 대장암 치료제로 사용할 수 있다. The present invention relates to a composition for preventing or treating colon cancer, containing 3,6-anhydro-L-galactose, and more specifically, provides excellent anti-cancer effects by inducing apoptosis of colon cancer cells and inhibiting the growth of colon cancer cells by using 3,6-anhydro-L-galactose separated from red algae-derived agar and purified. 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물: [화학식 1] 제1항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 유래의 한천에서 분리 및 정제한 것인 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물. 제2항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 전처리 된 아가로오스에서 아가로올리고당을 제조하고, 상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소적 당화 과정을 거쳐 분리 정제한 것인 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물. 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물: [화학식 1] 제5항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 유래의 한천에서 분리 및 정제한 것인 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물. 제6항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 전처리 된 아가로오스에서 아가로올리고당을 제조하고, 상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소적 당화 과정을 거쳐 분리 정제한 것인 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물. 대장암 치료에 사용하는 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose): [화학식 1]
