AGAROOLIGOSACCHARIDE HYDROLASE AND METHOD FOR PRODUCING 3,6-ANHYDRO-L-GALACTOSE AND GALACTOSE FROM AGAROSE BY USING SAME

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 아가로오스 분해효소; 아가로트리오스 분해 활성이 있고, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열로 표시되는 베타-아가로올리고당 가수분해효소(β-agarooligosaccharide hydrolase); 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 포함하는, 아가로오스 당화용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 아가로오스 당화용 조성물은 아가로올리고당 가수분해 산물인 아가로트리오스를 네오아가로바이오스와 D-갈락토오스로 가수분해하는 베타-아가로올리고당 가수분해효소를 아가로오스 당화에 사용함으로써 종래기술에서는 가수분해되지 않고 잔존하는 아가로트리오스를 효과적으로 분해하여 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스의 생산 효율 즉, 아가로오스 당화 효율을 현저히 개선한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 환원당 정량법(DNS법)으로 환원당량을 확인한 결과, 아가로오스를 전처리만 하였을 경우 당화율은 약 20%이고, 종래의 효소적 처리 즉, 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소를 처리한 경우에는 50%까지 상승한다. 반면, 상기 효소적 처리 시 베타-아가로올리고당 가수분해효소를 추가로 처리하여 아가로트리오스를 가수분해한 경우 70%의 당화율을 나타낸다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 기존에 보고된 베타-갈락토시데이즈가 나타내는 활성을 보이지 않으며, 그 대신 아가로트리오스 뿐 아니라 다양한 아가로올리고당(n), 예컨대, 아가로펜타오스, 아가로헵타오스의 비환원성말단에 작용하여 아가로올리고당을 D-갈락토오스와 네오아가로바이오스(n-1)로 가수분해할 수 있다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 아가로트리오스 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다('AOH'라고도 함).

본 발명에서 폴리펩티드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc. Natl Acad. Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST(BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med.(NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.

본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본원에서는 아미노산 잔기에 대하여 통상의 1문자 또는 3문자 코드가 사용된다.

본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적 (비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.

본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.

핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션 (transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 2에 기재된 서열로부터 전사 및 번역될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.

재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다. 또한 본 발명의 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 예컨대 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 대장균의 배양물 상등액 또는 상청액을 대체하여 이용할 수 있다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 HisTrap HP column과 HisTrap FF column을 이용하여 분리 정제할 수 있다. 분리 정제된 상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소의 분자량은 일 구체예에 따르면, SDS-PAGE 분석 결과 대략 90kDa일 수 있다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 GH family 2에 속하는 효소로, 다른 GH family 2에 속하는 베타-갈락토시데이즈들과의 활성을 비교할 경우, 종래의 보고된 베타-갈락토시데이즈는 아가로트리오스를 분해하여 D-갈락토오스 및 네오아가로바이오스를 생산하는 활성을 나타내지 않으나, 본 발명의 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 유래의 상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소만이 아가로트리오스 분해 활성을 나타낼 수 있다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 아가로트리오스에 대해 약 30 내지 40℃에서, 약 pH 5 내지 9.6에서 최적 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 아가로오스 당화용 조성물은 아가로올리고당을 분해하여 아가로트리오스와 이당체인 네오아가로바이오스를 생산하는 아가로오스 분해효소를 포함한다.

상기 아가로오스 분해효소는 아가로오스의 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소('Aga50D'라 함)를 사용할 수 있다.

상기 아가로오스 분해효소는 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 아가로올리고당 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 3에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

상기 효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40^T에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 아가로오스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40^T의 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.

재조합 기술을 이용하는 경우, 상기 아가로오스 분해효소는 식용균주, 예컨대 효모에 형질전환시켜 형질전환된 효모의 배양물 상등액을 대체하여 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 아가로오스 당화용 조성물은 네오아가로바이오스를 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스로 분해할 수 있는 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소('sdNABH'라 함)를 포함한다.

상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열 뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 네오아가로바이오스 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

상기 효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40^T에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40^T의 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40^T 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.

재조합 기술을 이용하는 경우, 식용균주, 예컨대 효모에 형질전환시켜 형질전환된 효모의 배양물 상등액 또는 상청액을 대체하여 이용할 수 있다.

본 발명의 아가로오스 당화용 조성물은 전처리된 아가로오스와, 아가로오스 분해효소, 베타-아가로올리고당 가수분해효소 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시키거나,

전처리된 아가로오스와, 아가로오스 분해효소, 베타-아가로올리고당 가수분해효소 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 D-갈락토오스를 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 기질은 아가로오스, 아가로트리오스 및 네오-아가로바이오스로 이루어진 군에서 선택되고, 본 발명에 따른 아가로오스 당화용 조성물을 상기 기질과 반응시켜 아가로오스를 당화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 아가로오스를 당화하는 방법은 전처리된 아가로오스에 엑소-타입의 베타 아가레이즈인 아가로오스 가수분해효소, 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소 및 베타-아가로올리고당 가수분해효소를 반응시켜 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 D-갈락토오스를 제조하는 것을 특징으로 한다.

상기 전처리된 아가로오스는 아가로오스에 약산을 처리하여 아가로올리고당을 제조하는 것을 의미한다.

상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 또는 옥살산(Oxalic acid) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

상기 약산은 생산단가 및 약산 중화 후 생성되는 염의 분리를 고려하여 0.5 내지 60%(w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로 20 내지 40%(w/v)의 농도로 사용할 수 있다.

상기 아가로오스 및 약산의 반응은 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 실시할 수 있다. 상기 범위 내일 경우 약산에 의한 아가로오스의 과분해산물을 최소화할 수 있다.

상기 반응 후 얻은 반응산물은 아가로올리고당으로 잔존하는 약산과 과분해산물을 제거하기 위해 세척 후 건조하여 분말상태로 수득할 수 있다.

상기 세척 용매로 탄소 수 1 내지 6의 저급 알코올을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기에서 얻은 아가로올리고당의 효소적 분해를 위해 엑소 타입의 아가로오스 가수분해효소, 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소 및 베타-아가로올리고당 가수분해효소를 사용한다.

아가로오스 가수분해효소는 아가로올리고당을 아가로트리오스와 네오아가로바이오스로 분해하고, 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 아가로트리오스를 D-갈락토오스와 네오아가로바이오스로 분해하며, 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 네오아가로바이오스를 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해한다.

따라서, 아가로올리고당의 기존의 효소적 분해 시 잔존하는 아가로트리오스는 베타-아가로올리고당 가수분해효소에 의해 분해되어 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산 수율이 개선되는 것이다.

상기 전처리된 아가로오스와, 아가로오스 분해효소, 베타-아가로올리고당 가수분해효소 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시키거나,

전처리된 아가로오스와, 아가로오스 분해효소, 베타-아가로올리고당 가수분해효소 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 D-갈락토오스를 제조할 수 있으며,

상기 아가로올리고당과 효소 혼합물의 반응 또는 아가로올리고당과 효소들의 순차적 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일간 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.

상기 아가로올리고당이 분말상태인 경우 통상의 완충용액에 녹여 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 또한 아가로트리오스, 아가로펜타오스 또는 아가로헵타오스 분해 활성이 있고, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열로 표시되는 베타-아가로올리고당 가수분해효소(β-agarooligosaccharide hydrolase)를 포함하는 갈락토오스 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 기질로 아가로트리오스, 아가로펜타오스 또는 아가로헵타오스를 사용하고, 본 발명의 베타-아가로올리고당 가수분해효소와 상기 기질을 반응시켜 갈락토오스를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 유래일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

상기 베타-아가로올리고당 가수분해효소는 아가로트리오스, 아가로펜타오스 또는 아가로헵타오스를 D-갈락토오스 및 네오아가로바이오스를 제조하므로 D-갈락토오스 제조에 사용할 수 있다.

효소 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 pH 5 내지 9.6에서 실시할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.